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Kit N-glicani HCP0031A Immagine in evidenza
  • Kit N-glicani HCP0031A

Kit N-glicani


N. cat.: HCP0031A

Confezione: 5T/24T/96T

Questo documento fornisce informazioni riguardanti la cura generale e l'uso del kit N-Glycan per il rapido rilascio enzimatico e la rapida etichettatura degli N-glicani.

Descrizione del prodotto

Dati del prodotto

Descrizione del prodotto

Questo documento fornisce informazioni riguardanti la cura generale e l'uso del kit N-Glycan per il rapido rilascio enzimatico e la rapida etichettatura degli N-glicani.Questo protocollo è convalidato utilizzando anticorpi monoclonali ed è stato anche testato per funzionare con un'ampia gamma di altre glicoproteine ​​N-linked.Consigliamo all'utente di confermare il rilascio enzimatico per il proprio campione specifico.


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  • Componenti

    N-Kit glicani (24T)

    Modulo

    Ccomponente

    HCP0031A

     

    Modulo di deglicosilazione

    HCP0031A-1

    IgG

    1,2 mg

    PNGase F

    45 µl

    Tampone PNGase F

    0,5 ml

    Tensioattivo

    1,2 mg*6

    Modulo di etichettatura

    HCP0031A-2

    Polvere di reagente MS

    8,2 mg*3

    DMF anidro

    1 ml

    Modulo di pulizia

    HCP0031A-3

    Piastra di eluizione (96 pozzetti)

    1 pezzo

    Tampone di eluizione

    5 ml*1

    Diluente del campione

    5 ml*1

     

    Modulo di raccolta campioni

    HCP0031A-4

    Strisce da 8 provette (200μL)

    100 pezzi

    Strisce da 8 tappi

    100 pezzi

    Piatto di raccolta (96 pozzetti)

    1 pezzo

    Vassoio per rifiuti

    1 pezzo

    Protocollo

    L'utente deve preparare i seguenti reagenti e dispositivi prima di iniziare (un campione di IgG come esempio):

    (1) 0,85% Nacl, 100 µl;acetonitrile (grado LC-MS) ;acqua ultrapura ;

    (2)15/85=soluzione di acqua ultrapura/acetonitrile (v/v), 2 ml;1/9/90=acido formico/acqua ultrapura/acetonitrile (v/v), 20 ml; formiato di ammonio 50 mM, pH=4,4, 500 ml;

    (3) Pompa per vuoto SPE;Processore a pressione negativa o processore a pressione positiva per piastre da 96 pozzetti;Modulo riscaldante o bagno metallico( 90℃e 50℃);miscelatore vortex; pipetta.

     

    Fase 1:Deglicosilazione rapida

    (1) Diluire il campione di IgG con Nacl allo 0,85% per ottenere la concentrazione finale di IgG a 2 mg/mL.

    (2) Tampone PNGase F: diluire 1 fiala di tensioattivo (1,2 mg/3,6 mg) con (24 μL/72 μL)) tampone PNGase F, mescolare e conservare a temperatura ambiente (questa soluzione deve essere preparata prima dell'uso).

    (3) Aggiungere 20μL di soluzione IgG alla provetta di reazione da 200μL, aggiungere 3μL di tampone PNGase F, pipettare su e giù per miscelare, quindi aggiungere 3,3μL di acqua ultrapura, aspirare ed erogare per miscelare.

    (4) Aggiungere tutta la soluzione di cui sopra al modulo riscaldante a 90 ℃, 3 minuti, denaturarla, quindi estrarla dal modulo riscaldante e lasciarla raffreddare per 3 minuti a temperatura ambiente.

    (5) Aggiungere 1,2μL di PNGase F, aspirare ed erogare per miscelare, riscaldare a 50°C, 5 minuti con il modulo riscaldante.L'utente può preparare il reagente per l'etichettatura durante l'attesa.

    (6) Toglierlo dal modulo riscaldante e lasciarlo raffreddare per 3 minuti a temperatura ambiente.

     

    Passaggio 2. Etichettatura rapida delle glicosilamine

    (1) Soluzione di reagente per l'etichettatura: diluire una fiala di reagente per l'etichettatura (8,2 mg/24,6 m) con DMF anidro (60,13 μL/180,4 μL), questa soluzione deve essere preparata prima dell'uso), aspirare e dispensare 5-10 volte per garantire il reagente è completamente disciolto.

    (2) Aggiungere 6μL di soluzione di reagente di etichettatura alla provetta di reazione, aspirare ed erogare 5-10 volte per garantire la miscelazione, quindi consentire alla reazione di etichettatura di procedere a temperatura ambiente

    temperatura per 5 minuti.

    (3) Aggiungere 179 μL di acetonitrile, mescolare per il passaggio successivo.

     

    Passaggio 3: pulizia di Etichettato con Glycosylaminiere

    (1) Configurare il processore a pressione negativa o il processore a pressione positiva e la piastra di eluizione a 96 pozzetti.

    (2) Condizionamento dei pozzetti: aggiungere 200μL di acqua ultrapura alla piastra di eluizione per condizionare i pozzetti, raccogliere i rifiuti tramite il vassoio dei rifiuti.

    (3)Equilibrare i pozzetti: aggiungere 200μL di soluzione acqua/acetonitrile 15/85 (v/v) per equilibrare i pozzetti, raccogliere gli scarti tramite il vassoio degli scarti.

    (4) Caricare il campione: caricare i campioni diluiti con acetonitrile e raccogliere gli scarti nel vassoio degli scarti.

    (5) Lavare i pozzetti con 600μL di acido formico 1/9/90/acqua ultrapura/acetonitrile(v/v) due volte e raccogliere i rifiuti nel vassoio dei rifiuti.

    (6) Rimuovere il vassoio dei rifiuti e sostituirlo con un piatto di raccolta.

    (7)Lavare la cella con 50μL di tampone di eluizione, eluire i glicani nella piastra di raccolta e ripetere questo passaggio.

    (8)Aggiungere 200μL di diluente del campione e mescolare.

    Passaggio 4. HILIC-FLR

    (1) Colonna cromatografica: ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amide, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 x 150 mm (codice acque n. 186004742).

    (2) Temperatura della colonna: 60 °C

    (3) Fase liquida A: soluzione di formiato di ammonio da 50 mM (si consiglia il grado LC-MS), pH = 4,4.

    (4) Fase liquida B:100% acetonitrile(Il grado LC-MS èconsigliato).

    (5) Portata: 0,4 ml/min;

    (6) Gradiente:

    Tempo (minuti)

    Portata (mL/min)

    %A

    %B

    Curva

    0

    0.4

    25

    75

    6

    35

    0.4

    46

    54

    6

    36,5

    0,2

    100

    0

    6

    39,5

    0,2

    100

    0

    6

    43.1

    0,2

    25

    75

    6

    47.6

    0.4

    25

    75

    6

    55

    0.4

    25

    75

    6

    (7)Lunghezze d'onda FLR: EX 265/EM 425 nm

    (8)Frequenza di campionamento FLR: 2 Hz

    (9)Volume di iniezione: 10μL

    Si prega di notare che i parametri sopra indicati si basano sulla macchina dotata di LCMS "ACQUITY® RDa", l'utente può regolare di conseguenza il parametro su altre apparecchiature.

     

    Sstoccaggio

    Reagente

    Magazzinaggio

    IgG

    2-8 ℃, 12 mesi

    PNGase F

    -25 ~ – 15℃℃, 12 mesi, da evitare

    cicli di congelamento/scongelamento

    Tampone PNGase F

    2-8 ℃, 12 mesi

    Tensioattivo

    Temperatura ambiente, 12 mesi

    Reagente MS in polvere

    2-8℃, 12 mesi, tenere al buio

    DMF anidro

    Temperatura ambiente, 12 mesi

    Tampone di eluizione

    Temperatura ambiente, 12 mesi

    Diluente del campione

    Temperatura ambiente, 12 mesi

    Piastra di eluizione da 96 pozzetti

    A temperatura ambiente, una volta aperto, il pozzetto inutilizzato deve essere sigillato con la pellicola di paraffina in plastica e conservare l'essiccante a temperatura ambiente

    Strip da 200μL da 8 provette, strip da

    8 tappi, piastra di raccolta da 96 pozzetti, vassoio di scarto

    Temperatura ambiente, raccolta a 96 pozzetti

    la piastra sia sigillata e mantenga l'essiccante a temperatura ambiente

     

    Appunti

    Per la vostra sicurezza e salute, indossate camice da laboratorio e guanti.

    Utilizzare punte pulite ogni volta

    Seguire il manuale per conservare e utilizzare i reagenti

     

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