Mini kit per l'estrazione del DNA

Condizioni di archiviazione

Conservare a -15 ~ -25 ℃ e trasportare a temperatura ambiente.

Componenti

PIL tampone:Tampone di legame del DNA.

GW tampone:Tampone di lavaggio;aggiungere etanolo assoluto nel volume indicato sulla bottiglia prima dell'uso.

Tampone di eluizione:Eluizione.

Mini colonne FastPure DNA-G:Colonne di adsorbimento del DNA.

Provette di raccolta da 2 ml:Provette di raccolta per filtrato.

Materiali preparati

Provette sterilizzate da 1,5 ml, etanolo assoluto e isopropanolo (quando il frammento di DNA ≤100 bp, aggiungere 1 volume

isopropanolo a 1 volume di gel), bagnomaria.

Processo dell'esperimento

Aggiungere 80 ml di etanolo per diluire Buffer GW come indicato sull'etichetta prima dell'uso, conservare a temperatura ambiente.

Meccanismo

1. Soluzione di reazione PCR

Schema di estrazione del gel: aggiungere un volume uguale di tampone GDP, schema di recupero della soluzione di reazione PCR:Aggiungere 5 volte il volume del Buffer

2. PIL Calcolare il volume del gel(100  μl equivale a 100 mg)

Sciogliere il gel

3. Preriscaldare a 50 ~ 55℃

4. Rilegatura Lavaggio

Aggiungere 300 μl di tampone GDP*

Aggiungere 700 μL di tampone GW

Aggiungere 700 μL di tampone GW

5. Eluire

Aggiungere 20 – 30μL di tampone di eluizione o acqua deionizzata

Note* Recupero del fluido di reazione PCR senza questo passaggio

Programma di estrazione del gel

1. Dopo l'elettroforesi del DNA per il frazionamento dei frammenti di DNA, asportare la singola striscia di frammento di DNA dal gel di agarosio sotto luce UV.Si consiglia di utilizzare carta assorbente per assorbire l'umidità apparente del gel e ridurre al minimo le dimensioni della fetta di gel rimuovendo il più possibile l'agarosio in eccesso.Pesare la fetta di gel (senza provetta per microcentrifuga) per calcolarne il volume: il volume di una fetta di gel da 100 mg è di circa 100 μL, presupponendo che la densità sia 1 g/ml.

2. Aggiungere un volume uguale di tampone GDP, incubare a 50~55℃ per 7-10 minuti (a seconda delle dimensioni del gel, regolare il tempo di incubazione fino alla completa dissoluzione del gel).Capovolgere la provetta 2 volte durante l'incubazione.

Δ L'aggiunta di 1-3 volumi di Buffer GDP non influenzerà l'efficienza di recupero del DNA.Se il frammento di DNA da recuperare <100 bp è necessario aggiungere 3 volumi di Buffer GDP;quando la fetta di gel si è sciolta completamente, aggiungere 1 volume di isopropanolo e mescolare accuratamente, quindi continuare con il passaggio successivo.

3. Centrifugare brevemente per portare il campione sul fondo della provetta, inserire le FastPure DNA Mini Columns-G nelle provette di raccolta da 2 ml, trasferire con attenzione la soluzione al massimo di 700 μL una volta alla volta.

tempo alle colonne di filtrazione, centrifugare a 12.000 giri/min (13.800 X g) per 30-60 sec.

4. Eliminare il filtrato e aggiungere 300 μl di tampone GDP alla colonna, incubare a temperatura ambiente per 1 minuto, centrifugare a 12.000 giri/min (13.800 X g) per 30-60 secondi.

5. Scartare il filtrato e aggiungere 700 μL di Buffer GW (controllare se è stato aggiunto in anticipo etanolo assoluto!) alla colonna, centrifugare a 12.000 giri/min (13.800 X g) per 30-60 secondi.

Δ Aggiungere Buffer GW attorno alla parete della colonna di adsorbimento, oppure aggiungere il coperchio posteriore di Buffer GW e mescolare capovolto per 2 – 3 volte per aiutare a eliminare completamente il sale che aderisce alla parete del tubo.

6. Ripetere il passaggio 5.

Δ Il lavaggio con Buffer GW due volte può garantire la completa rimozione del sale ed eliminare l'impatto sugli esperimenti successivi.

7. Eliminare il filtrato e centrifugare la colonna vuota a 12.000 giri/min (13.800 X g) per 2 minuti.

8. Inserire la colonna in una provetta per microcentrifuga pulita da 1,5 ml, aggiungere 20 - 30 μL di tampone di eluizione al centro della membrana della colonna, incubare per 2 minuti, quindi centrifugare a 12.000 giri/min (13.800 X g) per 1 minuto.Scartare la colonna, conservare il DNA ottenuto a -20 .

Δ Il trasferimento del surnatante della fase 8 nella colonna per eluire nuovamente e il preriscaldamento del tampone di eluizione a 55 (quando il frammento di DNA >3 kb) può essere utile per aumentare l'efficienza di recupero.

Programma di recupero dei prodotti PCR

Questo protocollo è applicabile per purificare frammenti di DNA da prodotti PCR, sistemi di reazione enzimatica e altri prodotti grezzi di DNA (compreso il DNA genetico).Questa soluzione può rimuovere efficacemente vari nucleotidi, primer, dimeri di primer, molecole di sale, enzimi e altre impurità.

1. Centrifugare brevemente i prodotti della PCR, la soluzione di reazione enzimatica e altri prodotti grezzi del DNA.Stimare il loro volume con una pipetta e trasferirlo in una provetta sterilizzata da 1,5 ml o 2 ml.Aggiungere ddH2O fino al volume fino a 100 μL;mentre per il DNA genomico ad alta concentrazione, la diluizione a 300 μL con ddH2O aiuterà a migliorare l'efficienza di recupero.

2. Aggiungere 5 volumi di Buffer GDP, mescolare accuratamente capovolgendo o agitando nel vortex.Se il frammento di DNA di interesse >100 bp, è necessario aggiungere ulteriori 1,5 volumi (campioni + Buffer GDP) di etanolo.

3. Reinserire la colonna nella provetta di raccolta, trasferire la miscela nella colonna, centrifugare a 12.000 giri/min (13.800 ×g) per 30 – 60 secondi.Se il volume della soluzione miscelata è >700 µL, rimettere la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta, trasferire la soluzione rimanente nella colonna di adsorbimento e centrifugare a 12.000 giri/min (13.800 × g) per 30 – 60 secondi.

4. L'esecuzione successiva si riferisce agli step 5 – 8 del programma 08-1/Estrazione gel.