Trascrittasi inversa M-MLV
RevScript La trascrittasi inversa è ottenuta mediante la tecnologia dell'ingegneria genetica.Ha una maggiore capacità di sintesi del cDNA, stabilità termica e limite di temperatura di reazione (fino a 60°C).Il prodotto cDNA sintetizzato arriva fino a 10 kb.Migliora l'affinità dei modelli ed è adatto per la trascrizione inversa di modelli di RNA con struttura secondaria complessa o geni a bassa copia.
Componenti
| Componente | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| Trascrittasi inversa RevScript (200U/μL) | 50 µl | 5×50 microlitri | 1 ml |
| 5 buffer RevScript | 250 µl | 1,25 ml | 5 ml |
Condizioni di conservazione
Questo prodotto deve essere conservato a -25°C~-15°C per 2 anni.
Definizione di unità
Una unità incorpora 1 nmol di dTTP in materiale insolubile in acido in 10 minuti a 37°C utilizzando Oligo(dT) come primer.
Impostazione della reazione
1.Denaturazione del modello di RNA (questo passaggio è facoltativo, la denaturazione del modello di RNA aiuta ad aprire le strutture secondarie, migliorando la resa del cDNA del primo filamento.)
| Componenti | Volume (μL) |
| DdH libero da RNasi2O | Fino alle 13 |
| Oligo(dT)18 (50μmol/L) o Random Primer (50 μmol/L) Oppure primer gene specifici (2 μmol/L) | 1 |
| o 1 | |
| o 1 | |
| Modello di RNA | X a |
Appunti:
1) a: RNA totale: 1-5 ug o mRNA: 1-500 ng
2) Incubare a 65°C per 5 minuti, quindi trasferire immediatamente in ghiaccio per raffreddare per 2 minuti.Breve centrifugazione per raccogliere il liquido di reazione, aggiungere la soluzione di reazione di trascrizione inversa come mostrato nella tabella seguente.Pipettare delicatamente per mescolare.
1.Preparazione della miscela di reazione (volume 20 μL)
| Componenti | Volume (μL) |
| Miscela del passaggio precedente | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| Miscela dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Trascrittasi inversa (200 U/μL) | 1 |
| Inibitore della RNasi (40 U/μL) | 1 |
1.Eseguire la reazione nelle seguenti condizioni:
| Temperatura (°C) | Tempo |
| 25 °Ca | 5 minuti |
| 42 °Cb | 15-30 minuti |
| 85 °Cc | 5 minuti |
Appunti:
1) un.L'incubazione a 25°C per 5 minuti è necessaria solo per l'utilizzo degli esameri casuali.Si prega di saltare questo passaggio quando si utilizza Oligo (dT)18o primer gene specifico.
2) b.La temperatura di trascrizione inversa consigliata è 42°C. Per modelli con strutture secondarie complicate o alto contenuto di GC, si consiglia di aumentare la temperatura di reazione a 50-55°C.
3) c.Riscaldamento a 85°C per 5 minuti per inattivare la trascrittasi inversa.
4) Il prodotto può essere utilizzato direttamente nelle reazioni PCR o qPCR o conservato a -20°C per una conservazione a breve termine.Si consiglia di allineare i prodotti e conservarli a -80°C per una conservazione a lungo termine.Evitare frequenti fenomeni di congelamento-scongelamento.
5) Il prodotto è adatto per RT-qPCR one-step, si consiglia di aggiungere 10-20 U di trascrittasi inversa per ogni sistema di reazione da 25μL o aumentare gradualmente la quantità di trascrittasi inversa in base alla situazione reale.
Appunti
1.Si prega di mantenere pulita l'area sperimentale;Durante il funzionamento è necessario indossare guanti e maschere puliti.Tutti i materiali di consumo utilizzati nell'esperimento devono essere privi di RNasi per prevenire la contaminazione da RNasi.
2.Tutte le procedure devono essere eseguite su ghiaccio per prevenire la degradazione dell'RNA.
3.Si consigliano campioni di RNA di alta qualità per garantire un'elevata efficienza della trascrizione inversa.
4.Questo prodotto è solo per uso di ricerca.
5.Si prega di operare con camici da laboratorio e guanti monouso, per la vostra sicurezza.
