Trascrittasi inversa M-MLV Neoscript
La trascrittasi inversa Neoscript è una trascrittasi inversa ottenuta mediante screening della mutazione del gene M-MLV dell'origine e dell'espressione del virus della leucemia murina Moloney in E.coli.L'enzima rimuove l'attività della RNasi H, ha una tolleranza alla temperatura più elevata ed è adatto per la trascrizione inversa ad alta temperatura.Pertanto, è utile per eliminare gli effetti sfavorevoli della struttura di alto livello dell'RNA e dei fattori non specifici sulla sintesi del cDNA e ha una maggiore stabilità e capacità di sintesi della trascrizione inversa.L'enzima ha una maggiore stabilità e capacità di sintesi della trascrizione inversa.
Componenti
1.200 U/μL di trascrittasi inversa Neoscript
2.5 × buffer del primo filamento (opzionale)
* 5 × buffer del primo filamento non contengono dNTP, aggiungere dNTP durante la preparazione del sistema di reazione
Applicazione consigliata
1.qRT-PCR in un unico passaggio.
2.Rilevamento del virus dell'RNA.
Condizioni di conservazione
-20°C per la conservazione a lungo termine, deve essere miscelato bene prima dell'uso, evitare frequenti congelamenti e scongelamenti.
Definizione di unità
Una unità incorpora 1 nmol di dTTP in 10 minuti a 37°C utilizzando poli(A)•oligo(dT)25come modello/primer.
Controllo di qualità
1.Purezza elettroforetica SDS-PAGE superiore al 98%.
2.Sensibilità di amplificazione, controllo batch-to-batch, stabilità.
3.Nessuna attività nucleasica esogena, nessuna contaminazione da endonucleasi o esonucleasi esogena
Impostazione della reazione per la soluzione della prima reazione a catena
1.Preparazione della miscela di reazione
| Componenti | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Primer o Primer casualeUN O primer specifici del geneb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| dNTP 10 mM | 1 ml |
| Modello RNA | RNA totale ≤ 5μg;mRNA ≤ 1 μg |
| dH privo di RNasi2O | A 10 µl |
Appunti:a/b: selezionare diversi tipi di primer in base alle proprie esigenze sperimentali.
2.Riscaldare a 65°C per 5 minuti e raffreddare rapidamente in ghiaccio per 2 minuti.
3.Aggiungere i seguenti componenti al sistema sopra indicato per un volume totale di 20 µl e mescolare delicatamente:
| Componenti | Volume (μL) |
| 5 × Buffer del primo filamento | 4 |
| Trascrittasi inversa Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inibitore della RNasi (40 U/μL) | 1 |
| dH privo di RNasi2O | A 20 µl |
4.Si prega di eseguire la reazione secondo le seguenti condizioni:
(1) Se si utilizza Random Primer, la reazione deve essere eseguita a 25℃ per 10 minuti, quindi a 50℃ per 30~60 minuti;
(2) Se si utilizzano Oligo dT o primer specifici, la reazione deve essere condotta a 50°C per 30~60 minuti.
5.Riscaldare a 95℃ per 5 minuti per inattivare la trascrittasi inversa Neoscript e terminare la reazione.
6.I prodotti di trascrizione inversa possono essere utilizzati direttamente nella reazione PCR e nella reazione PCR quantitativa a fluorescenza o conservati a -20 ℃ per lungo tempo.
PCR Razione:
1.Preparazione della miscela di reazione
| Componenti | Concentrazione |
| 10 × tampone PCR (senza dNTP, senza Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM ogni dNTP) | 200μM |
| MgCl 25 mM2 | 1-4 mm |
| Taq DNA polimerasi (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10μM) | 0,2-1μM |
| Primer 2 (10μM) | 0,2-1μM |
| ModelloUN | ≤10% Soluzione della prima reazione a catena (2 μL) |
| DDH2O | A 50 µl |
Appunti:a: Se viene aggiunta una quantità eccessiva di soluzione della prima reazione a catena, la reazione PCR potrebbe essere inibita.
2.Procedura di reazione PCR
| Fare un passo | Temperatura | Tempo | Cicli |
| Pre-denaturazione | 95 ℃ | 2-5 minuti | 1 |
| Denaturazione | 95 ℃ | 10-20 secondi | 30-40 |
| Ricottura | 50-60℃ | 10-30 secondi | |
| Estensione | 72℃ | 10-60 secondi |
Appunti
1.Adatto per l'ottimizzazione della temperatura della trascrizione inversa nell'intervallo 42℃~55℃.
2.Ha una migliore stabilità, è adatto per l'amplificazione della trascrizione inversa ad alta temperatura.Inoltre, è favorevole per passare in modo efficiente attraverso complesse regioni strutturali dell'RNA.Inoltre, essoè adatto per il rilevamento quantitativo RT-PCR a fluorescenza multiplex one-step.
3.Buona compatibilità con vari enzimi di amplificazione PCR ed è adatto per reazioni RT-PCR ad alta sensibilità.
4.Adatto per la reazione RT-PCR quantitativa a fluorescenza monofase ad alta sensibilità, migliora efficacemente il tasso di rilevamento di basse concentrazioni di modelli.
5.Adatto per la costruzione di librerie di cDNA.
