Kit PCR diretta vegetale
N. cat.: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit è adatto per l'amplificazione diretta di foglie, semi, ecc. di piante e può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività di campioni di piante che non contengono polisaccaridi e polifenoli.La DNA polimerasi ad amplificazione diretta basata sull'evoluzione diretta ha una tolleranza superiore agli inibitori della PCR nelle piante.Nel frattempo, mantiene le elevate prestazioni di amplificazione, adatte per l'amplificazione di frammenti di DNA entro 5 kb.L'esclusivo tampone di lisi A contenuto nel kit può essere utilizzato per lisare tessuti vegetali freschi o congelati.È facile da usare e il lisato può essere utilizzato come modello per l'amplificazione senza purificazione.Il sistema contiene agenti protettivi che consentono di amplificare efficacemente i campioni grezzi dopo ripetuti congelamenti e scongelamenti.2 × Plant Direct Master Mix richiede solo l'aggiunta di primer e modelli per eseguire la reazione di amplificazione, riducendo così le operazioni di pipettaggio e migliorando la produttività di rilevamento e la riproducibilità dei risultati.
Componenti
| Componenti | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Master Mix diretto alla pianta | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Tampone di lisi diretta vegetale A | 5 ml | 20 ml |
| Tampone di lisi diretta vegetale B* | 5 ml | 20 ml |
*Il tampone di lisi diretta vegetale B è un reagente opzionale utilizzato per neutralizzare il tampone di lisi diretta vegetale A per prolungare il tempo di conservazione dei campioni.Può essere utilizzato in base alla situazione reale.
Condizioni di archiviazione
2 × Plant Direct Master Mix, conservare a -30 ~ -15 ℃ ed evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti;Tampone di lisi diretta per piante, conservare a -30 ~ -15 ℃ o 2 ~ 8 ℃.
Processo dell'esperimento
Elaborazione del campione–Foglia di pianta
Metodo diretto:Si consiglia di utilizzare foglie giovani.Utilizzare un perforatore con un diametro fisso di 0,5 – 3 mm per ottenere un campione piccolo e uniforme, quindi aggiungere direttamente il campione al sistema PCR (si consiglia il sistema da 50 μl).Nota: assicurarsi che il campione sia nella soluzione PCR e non contro la parete della provetta.Se si utilizza la PCR diretta per amplificare frammenti lunghi e campioni complessi, l'utilizzo di un campione con un diametro più piccolo (0,5 – 1 mm) come modello può aiutare a ottenere risultati migliori.
Metodo di lisi macinante:Si consiglia di utilizzare foglie giovani.Prendere un piccolo pezzo di foglia (circa 1 – 3 mm di diametro), posizionarlo in 20 μl di Plant Direct Lysis Buffer Ab e macinarlo il più possibile (questo passaggio può essere eseguito comprimendo la foglia con una punta di pipetta da 100 μl per schiacciare il campione).Se si utilizzano volumi maggiori di tessuto fogliare (non superare i 7 mm), aumentare il volume del tampone di diluizione a 50 μl.Dopo che le foglie sono state macinate, la soluzione dovrebbe apparire verde.Dopo una breve centrifugazione, aggiungere 1 μl di surnatante al sistema PCR come modello di reazionec.
Metodo di lisi termica:Si consiglia di utilizzare foglie giovani.Prendere un piccolo pezzo di foglia (circa 1 – 3 mm di diametro), posizionarlo in 20 μl di Plant Direct Lysis Buffer A e scaldarlo a 95°C per 5 – 10 minuti.Il tempo di lisi può essere opportunamente prolungato per le foglie difficili da lisare (non più di 20 minuti).Se si utilizzano volumi maggiori di tessuto fogliare (non superare i 7 mm), aumentare il volume del tampone di diluizione a 50 μl.Dopo il riscaldamento, centrifugare brevemente e aggiungere 1 μl di surnatante al sistema PCR come modello di reazioneb.
Elaborazione del campione–Seme di piante
Metodo di lisi macinante:Utilizzare un bisturi per tagliare i semi con un diametro di 5 mm, aggiungerli a 100 μl di Plant Direct Lysis Buffer A e macinare il campione con la punta di una pipetta o altri strumenti.Vortexare brevemente e lasciare riposare a temperatura ambiente per 3 – 5 minuti.Assicurarsi che il campione di semi sia immerso nel tampone di diluizione.Dopo una breve centrifugazione, aggiungere 1 μl di surnatante al sistema PCR come modello di reazione.
Metodo di lisi termica:Utilizzare un bisturi per tagliare i semi con un diametro di 5 mm, aggiungerli a 100 μl di Plant Direct Lysis Buffer A e riscaldare a 95°C per 5 – 10 minuti.Il tempo di lisi può essere opportunamente prolungato per le foglie difficili da lisare (non più di 30 minuti).Dopo il riscaldamento, centrifugare brevemente e aggiungere 1 μl di surnatante al sistema PCR come modello di reazioneb.
UN.Per tagliare campioni di dimensioni adeguate è possibile utilizzare anche forbici o altri strumenti;se il punch o le forbici vengono riutilizzati, devono essere puliti con una soluzione di ipoclorito di sodio al 2% prima di ogni utilizzo per prevenire la contaminazione incrociata tra i campioni.
B.Assicurarsi che il tampone di lisi Plant Direct sia completamente sciolto prima dell'uso.Se il tampone è viscoso o presenta precipitati, può essere riscaldato a 37 ℃ per scioglierlo completamente prima dell'uso.
C.Il volume dello stampo nel sistema di reazione può essere regolato in modo appropriato in base alla differenza nel volume del materiale vegetale e del diluente aggiunti.
Tampone di lisi diretta vegetale
Il Plant Direct Lysis Buffer A contenuto in questo prodotto è stato rigorosamente ottimizzato per rilasciare il genoma della maggior parte dei tessuti vegetali ed è adatto per la conservazione a breve termine di piante grezze a 4°C.Se il campione deve essere conservato per un periodo di tempo più lungo (ad esempio, 1 – 2 mesi), si consiglia di trasferire il surnatante in una nuova provetta EP e conservarlo a -20℃.Per conservare i campioni in modo più stabile, aggiungere un volume uguale di Plant Direct Lysis Buffer B al surnatante trasferito, mescolare bene e conservare a -20℃.Il tempo di conservazione stabile varia a seconda dei campioni e degli stati della pianta.
Sistema di reazione
| DDH2O | A 20,0 µl | A 50,0 µl |
| 2 × Master Mix diretto alla piantaa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Campione di foglie/estratto grezzo di pianta(Fare riferimento a Elaborazione del campione) | Disco fogliare 0,5 – 3 mm/x µl | Disco fogliare 0,5 – 3 mm/x µl |
UN.Contiene Mg2+ad una concentrazione finale di 2 mM.
B.Si consiglia di utilizzare una concentrazione finale di 0,4μM per ciascun primer.L'uso eccessivo di primer porterà ad un aumento dell'amplificazione non specifica.
C.La quantità di campione utilizzato può essere regolata in base alla situazione reale.La quantità utilizzata in una singola reazione di campione lisato grezzo può essere regolata tra il 2% e il 20% del volume totale della reazione.L'utilizzo di una quantità eccessiva di campioni può causare errori di amplificazione.
Programma di reazione
| Passi | Temperatura | Tempo |
| Denaturazione iniziale | 98 ℃ | 5 minuti |
| Denaturazione | 95 ℃ | 10 secondi |
| Ricottura | 58 ~ 72 ℃ | 15 secondi |
| Estensione | 72℃ | 30 secondi |
| Estensione finale | 72℃ | 5 minuti |
UN.La denaturazione iniziale (98 ℃, 5 min) promuove la lisi del tessuto vegetale, rilasciando DNA genomico che può essere utilizzato per l'amplificazione PCR.Non abbreviare il tempo né diminuire la temperatura.
B.Si consiglia di impostarlo uguale al valore Tm del primer o 2 ~ 4℃ superiore al valore Tm.La DNA polimerasi ad amplificazione diretta utilizzata in questo prodotto è diversa dalla Taq DNA polimerasi convenzionale e presenta requisiti speciali per la temperatura di ricottura della reazione; l'uso di una temperatura di ricottura elevata può ridurre efficacemente l'amplificazione non specifica e migliorare l'efficienza dell'amplificazione.Per modelli complessi, l'amplificazione efficiente può essere ottenuta regolando la temperatura di ricottura e prolungando il tempo di estensione.
C.Se la lunghezza del prodotto di amplificazione è ≤1 kb, il tempo di estensione è fissato a 30 sec/kb;se la lunghezza del prodotto di amplificazione è >1 kb il tempo di estensione è fissato a 60 sec/kb.
D.Per campioni complessi o campioni con bassa resa di amplificazione, il numero di cicli può essere opportunamente aumentato a 40-50 cicli.
Applicazioni
È applicabile per l'amplificazione diretta di tessuti vegetali e lo screening ad alto rendimento di campioni vegetali che non contengono polisaccaridi e polifenoli.
Appunti
Solo per uso di ricerca.Da non utilizzare in procedure diagnostiche.
1. Per l'amplificazione di piante grezze o l'amplificazione diretta, si consiglia di utilizzare DNA genomico purificato come controllo positivo prima di iniziare l'esperimento per garantire che il sistema, i primer e le operazioni siano corretti.
2. La DNA polimerasi ad amplificazione diretta utilizzata in questo kit ha una forte attività di correzione di bozze.Se è necessario eseguire la clonazione TA, si consiglia di purificare il DNA prima di aggiungere l'adenina.
3. Guida alla progettazione del primer:
UN.Si raccomanda che l'ultima base all'estremità 3' del primer sia G o C.
B.Dovrebbero essere evitati disallineamenti consecutivi nelle ultime 8 basi all'estremità 3' del primer.C.Evitare strutture a forcina all'estremità 3' del primer.
D.Le differenze nel valore Tm del primer diretto e del primer inverso non devono essere superiori a 1℃ e il valore Tm deve essere regolato su 60 ~ 72℃ (si consiglia Primer Premier 5 per calcolare il valore Tm).
e.Le sequenze di primer aggiuntive che non corrispondono al modello non devono essere incluse nel calcolo del valore Tm del primer.
F.Si consiglia che il contenuto di GC del primer sia pari al 40%-60%.
G.La distribuzione complessiva di A, G, C e T nel primer dovrebbe essere il più uniforme possibile.Evitare di utilizzare regioni con elevati contenuti di GC o AT.
H.Evitare la presenza di sequenze complementari di 5 o più basi all'interno del primer o tra due primer ed evitare la presenza di sequenze complementari di 3 o più basi all'estremità 3' di due primer.
io.Utilizzare la funzione NCBI BLAST per verificare la specificità del primer per prevenire un'amplificazione non specifica.
