Proteinasi K NGS (polvere)
N. cat.: HC4507A
NGS Protease K è una serina proteasi stabile con elevata attività enzimatica e ampia specificità del substrato. L'enzima decompone preferenzialmente i legami esterei e peptidici adiacenti al terminale C degli amminoacidi idrofobici, degli amminoacidi contenenti zolfo e degli amminoacidi aromatici.Quindi, viene spesso utilizzato per degradare le proteine in peptidi corti.La proteasi K NGS è una tipica proteasi serina con l'Asp39-Il suo69-Ser224triade catalitica che è unica delle serina proteasi e il centro catalitico è circondato da due Ca2+siti di legame per la stabilizzazione, mantenendo un'elevata attività enzimatica in una gamma più ampia di condizioni.
Specifica
| Aspetto | Polvere amorfa da bianca a biancastra, liofilizzata |
| Attività specifica | ≥40U/mg solido |
| DNasi | Nessuno rilevato |
| RNasi | Nessuno rilevato |
| Carico biologico | ≤50CFU/g solido |
| Residuo di acido nucleico | <5 pg/mg solidi |
Proprietà
| Fonte | Album del tritirachio |
| Numero CE | 3.4.21.64(Ricombinante dall'album Tritirachium) |
| Peso molecolare | 29kDa (PAGINA SDS) |
| Punto isoelettrico | 7.81Fig.1 |
| pH ottimale | 7.0-12.0 (Tutti svolgono un'attività elevata) Fig.2 |
| Temperatura ottimale | 65℃Fig.3 |
| Stabilità del pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 ore) Fig.4 |
| Stabilità termica | Sotto 50 ℃ (pH 8,0, 30 minuti) Fig.5 |
| Stabilità di stoccaggio | Conservato a 25 ℃ per 12 mesi Fig.6 |
| Attivatori | Scheda di sicurezza, urea |
| Inibitori | Diisopropilfluorofosfato;fluoruro di benzilsolfonile |
Condizioni di archiviazione
Conservare la polvere liofilizzata a -25~-15 ℃ per lungo tempo lontano dalla luce;Dopo la dissoluzione, aliquotare nel volume appropriato per la conservazione a breve termine a 2-8 ℃ lontano dalla luce o per la conservazione a lungo termine a -25~-15 ℃ lontano dalla luce.
Precauzioni
Indossare guanti e occhiali protettivi durante l'utilizzo o la pesatura e mantenersi ben ventilati dopo l'uso.Questo prodotto può causare reazioni allergiche alla pelle e gravi irritazioni agli occhi.Se inalato può provocare sintomi allergici o asmatici o dispnea.Può causare irritazione respiratoria.
Definizione di unità
Un'unità di NGS Proteasi K è definita come la quantità di enzima necessaria per idrolizzare la caseina in 1 μmol di L-tirosina in condizioni di determinazione standard.
Preparazione dei reagenti
| Reagente | Produttore | Catalogare |
| Tecnica della caseinadal latte bovino | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 20040618 |
| Acido tricloroacetico | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 80132618 |
| Acetato di sodio | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 10018818 |
| Acido acetico | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 10011018 |
| Carbonato di sodio | Prodotto chimico SinopharmReagente Co., Ltd. | 10019260 |
| Folina-fenolo | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reagente I:
Substrato: soluzione di caseina da latte bovino all'1%: sciogliere 1 g di caseina di latte bovino in 50 ml di soluzione di fosfato di sodio 0,1 M, pH 8,0, riscaldare a bagnomaria a 65-70 °C per 15 minuti, mescolare e sciogliere, raffreddare con acqua, regolare con idrossido di sodio a pH 8,0 e diluire in 100 ml.
Reagente II:
Soluzione TCA: acido tricloroacetico 0,1 M, acetato di sodio 0,2 M e acido acetico 0,3 M (pesare successivamente 1,64 g di acido tricloroacetico + 1,64 g di acetato di sodio + 1,724 ml di acido acetico, aggiungere 50 ml di acqua deionizzata, regolare con HCl a pH 4,03 e diluire in 100ml).
Reagente III:
0,4 ml di soluzione di carbonato di sodio (pesare 4,24 g di carbonato di sodio anidro e scioglierli in 100 ml di acqua)
Reagente IV:
Reattivo fenolico folin: diluire 5 volte con acqua deionizzata.
Reagente V:
Diluente enzimatico: soluzione di fosfato di sodio 0,1 M, pH 8,0.
Reagente VI:
Soluzione standard di L-tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirosina disciolta con HCl 0,2 M.
Procedura
1. Accendere lo spettrofotometro UV-Vis e selezionare la misurazione fotometrica.
2. Impostare la lunghezza d'onda su 660 nm.
3. Accendere il bagnomaria, impostare la temperatura su 37 ℃, assicurarsi che la temperatura rimanga invariata per 3-5 minuti.
4. Preriscaldare 0,5 ml di substrato in una provetta da centrifuga da 2 ml a bagnomaria a 37 ℃ per 10 minuti.
5. Estrarre 0,5 ml di soluzione enzimatica diluita nella provetta da centrifuga preriscaldata per 10 minuti.Impostare il diluente enzimatico come gruppo vuoto.
6. Aggiungere 1,0 ml di reagente TCA immediatamente dopo la reazione.Mescolare bene e incubare a bagnomaria per 30 minuti.
7. Centrifugare la soluzione di reazione.
8. Aggiungere i seguenti componenti nell'ordine specificato.
| Reagente | Volume |
| Supernatante | 0,5 ml |
| Carbonato di sodio 0,4 M | 2,5 ml |
| Reagente fenolico di folina | 0,5 ml |
9. Mescolare bene prima di incubare a bagnomaria a 37°C per 30 minuti.
10.OD660è stato determinato come OD1;gruppo di controllo in bianco: il diluente enzimatico viene utilizzato per sostituire la soluzione enzimatica per determinare la OD660come OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Curva standard di L-tirosina: 0,5 ml di soluzione di L-tirosina a concentrazione diversa, 2,5 ml di carbonato di sodio 0,4 M, 0,5 ml di reagente fenolico Folin in una provetta da centrifuga da 5 ml, incubare a 37 ℃ per 30 minuti, rilevare OD660per diverse concentrazioni di L-tirosina, si ottiene la curva standard Y=kX+b, dove Y è la concentrazione di L-tirosina, X è OD600.
Calcolo
2: volume totale della soluzione di reazione (mL)
0,5: volume della soluzione enzimatica (mL)
0,5: volume del liquido di reazione utilizzato nella determinazione cromogenica (mL)
10: Tempo di reazione (min)
Df: Diluizione multipla
C: Concentrazione degli enzimi (mg/mL)
Figure
Fig.1 Residuo di DNA
| Campione | Ave C4 | Acido nucleico Recupero (pg/mg) | Recupero(%) | Nucleico totale Acido ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O senza RNA | Indeterminato | — | — | — |
Fig.2 pH ottimale
Fig.3 Temperatura ottimale
Fig.4 Stabilità del pH
Fig.5 Stabilità termica
Fig.6 Stabilità allo stoccaggio a 25℃
