Enzima di copertura del virus del vaccino

L'enzima di capping del virus Vaccinia deriva da un ceppo ricombinante di E. coli che trasporta i geni per l'enzima di capping del vaccinia.Questo singolo enzima è composto da due subunità (D1 e D12) e ha tre attività enzimatiche (RNA trifosfatasi e guanililtransferasi per la subunità D1 e guanina metiltransferasi per la subunità D12).L'enzima di capping del virus Vaccinia è efficace nel catalizzare la formazione della struttura del cappuccio, che può attaccare in modo specifico la struttura del cappuccio 7-metilguanilato (m7Gppp, Cap 0) all'estremità 5' dell'RNA.La struttura del cappuccio (Cap 0) svolge un ruolo importante nella stabilizzazione, nel trasporto e nella traduzione dell'mRNA negli eucarioti.Il tappamento dell'RNA mediante reazione enzimatica è un metodo efficace e semplice che può migliorare significativamente la stabilità e la traduzione dell'RNA per la trascrizione, la trasfezione e la microiniezione in vitro.

Componenti

Enzima di copertura del virus del vaccino (10 U/μL)

10×Buffer di copertura

Condizioni di archiviazione

-25～- 15℃ per la conservazione (Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento)

Buffer di archiviazione

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM,

DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, 0,1% Triton X-100, 50% glicerolo.

Definizione di unità

Un'unità di enzima di copertura del virus Vaccinia è definita come la quantità di enzima richiesta per incorporare 10 pmol di GTP in un trascritto di 80 nt in 1 ora a 37°C.

Controllo di qualità

Esonucleasi:10U di enzima di copertura del virus Vaccinia con 1μg di DNA digerito di λ-Hind III a 37 ℃ per 16 ore non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Endonucleasi:10U di enzima di copertura del virus Vaccinia con 1μg di λDNA a 37°C per 16 ore non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Nickase:10U di enzima di copertura del virus Vaccinia con 1 μg di pBR322 a 37 ℃ per 16 ore non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

RNasi:10U di enzima di copertura del virus Vaccinia con 1,6μg di RNA MS2 per 4 ore a 37°C non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

1.coliDNA:10U di Vaccinia virus Capping Enzyme vengono sottoposti a screening per la presenza di DNA genomico di E. coli utilizzando TaqMan qPCR con primer specifici per il locus 16S rRNA di E. coli.La contaminazione del DNA genomico di E. coli è ≤1 genoma di E. coli.

2.Batterico Endotossina: Test LAL, secondo la Farmacopea Cinese IV edizione 2020, metodo del test del limite del gel, regola generale (1143).Il contenuto di endotossine batteriche deve essere ≤10 EU/mg.

Sistema e condizioni di reazione

1. Protocollo di tappatura (volume di reazione: 20 μL)

Questa procedura è applicabile alla reazione di tappatura di 10μg di RNA (≥100 nt) e può essere ampliata in base alle esigenze sperimentali.

I) Combinare 10μg di RNA e H2O priva di nucleasi in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml fino ad un volume finale di 15,0 µL.*10×tampone di copertura: Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)

2) Riscaldare a 65℃ per 5 minuti seguito da un bagno di ghiaccio per 5 minuti.

3) Aggiungere i seguenti componenti nell'ordine specificato

*10×Tampone di copertura: Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)

4) Incubare a 37°C per 30 minuti, l'RNA è ora tappato e pronto per le applicazioni a valle.

Terminale 2.5′ reazione di etichettatura (volume di reazione: 20 μL)

Questo protocollo è progettato per etichettare l'RNA contenente un trifosfato 5' e può essere ampliato in base alle esigenze.L'efficienza dell'incorporazione dell'etichetta sarà influenzata dal rapporto molare di RNA: GTP, nonché dal contenuto di GTP nei campioni di RNA.

1) Combinare una quantità adeguata di RNA e H2O priva di nucleasi in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml fino a un volume finale di 14,0 µL.

2) Riscaldare a 65℃ per 5 minuti seguito da un bagno di ghiaccio per 5 minuti.

3)Aggiungere i seguenti componenti nell'ordine specificato.

** GTP MIX si riferisce a GTP e ad un numero limitato di marcatori.Per la concentrazione di GTP, rifalla nota 3.

4) Incubare a 37°C per 30 minuti, l'estremità 5' dell'RNA è ora etichettata e pronta per il downstream

Applicazioni

1. Tappare l'mRNA prima dei test di traduzione/traduzione in vitro

2. Etichettatura dell'estremità 5' dell'mRNA

Note sull'uso

1.Il riscaldamento della soluzione di RNA prima dell'incubazione con l'enzima di copertura del vaccino rimuove la struttura secondaria sull'estremità 5' del trascritto.Estendi il tempo a 60 minuti per le trascrizioni con note 5'end altamente strutturate.

2. L'RNA utilizzato per le reazioni di capping deve essere purificato prima dell'uso e sospeso in acqua priva di nucleasi.L'EDTA non deve essere presente e la soluzione deve essere priva di sali.

3. Per marcare l'estremità 5', la concentrazione totale di GTP dovrebbe essere circa 1-3 volte la concentrazione molare dell'mRNA nella reazione.

4. Il volume del sistema di reazione può essere aumentato o ridotto in base al volume effettivo.