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Reagente di trascrizione in vitro T7 ad alto rendimento (termostabile) HCP0036A Immagine in evidenza
  • Reagente di trascrizione in vitro T7 ad alta resa (termostabile) HCP0036A

Reagente di trascrizione in vitro T7 ad alta resa (termostabile)


N. cat.:HCP0036A

Confezione: 50T

Il kit di reagenti di trascrizione in vitro T7 ad alta resa (termostabile) è in grado di effettuare la trascrizione in vitro a temperature più elevate, fino a 50°C.

Descrizione del prodotto

Dati del prodotto

Il kit di reagenti di trascrizione in vitro T7 ad alta resa (termostabile) è in grado di effettuare la trascrizione in vitro a temperature più elevate, fino a 50°C.Il kit è in grado di sintetizzare trascritti di RNA ad alto rendimento utilizzando DNA lineare a doppio filamento contenente il promotore T7 come modello e NTP come substrato.Il kit è adatto per l'incorporazione di nucleotidi modificati per ottenere RNA marcato con biotina, marcato con colorante e radiomarcato.Il kit può anche essere applicato nella sintesi di mRNA con copertura co-trascrizionale con analoghi del cappuccio.Il kit contiene in alternativa i nucleotidi modificati N1-Me-pUTP.

Ciascuna reazione standard produce fino a 150-200 μg di RNA da 1 μg di modello di DNA.La dimensione della reazione può essere aumentata per produrre RNA a livello di milligrammo secondo necessità.

L'RNA sintetizzato dal kit è adatto per molte applicazioni, tra cui studi sulla struttura e sulla funzione dell'RNA, biochimica dei ribozimi, test di protezione dell'RNasi e blot basati sull'ibridazione, esperimenti sull'RNA antisenso e sull'RNAi.L'RNA sintetizzato dal kit è adatto anche per produrre la produzione enzimatica di RNA tappato mediante l'enzima di tappatura del vaccino e la 2'-O-metiltransferasi ed essere aggiunto alla poli(A) polimerasi per migliorare la stabilità e la competenza traduzionale dell'RNA utilizzato per la traduzione in vitro , trasfezione e microiniezione.


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  • Componenti

    Componente

    Concentrazione

    Volume

    ATP

    100 mm

    100 µl

    CTP

    100 mm

    100 µl

    GTP

    100 mm

    100 µl

    UTP

    100 mm

    100 µl

    N1-Me-pUTP

    100 mm

    100 µl

    10 × buffer IVT ad alto rendimento A

    /

    100 µl

    Miscela di enzimi (termostabile)

    /

    100 µl

     

    Condizioni di archiviazione

    Trasporto a temperatura inferiore a 0°C e stoccaggio a -25~- 15°C.

     

    Protocollo

    •Preparazione del modello di DNA

    DNA plasmidico linearizzato, prodotti PCR o oligonucleotidi di DNA sintetico possono essere utilizzati come modelli per la trascrizione in vitro con il kit. Il modello di DNA può essere sciolto in tampone TE o ddH2O privo di RNasi.

    Plasmide modelli: Il plasmide linearizzato deve contenere una regione del promotore T7 come modello di DNA.La qualità del plasmide linearizzato influisce sulla resa e sull'integrità dell'RNA.Il modello plasmidico completamente linearizzato della massima purezza è fondamentale per l'uso corretto del kit perché il plasmide circolare non viene terminato in modo efficace.La massima resa di trascrizione si ottiene con il modello di massima purezza.Per produrre un trascritto di RNA di lunghezza definita, il DNA plasmidico deve essere completamente linearizzato con un enzima di restrizione che genera estremità smussate o sporgenze 5'.Il plasmide linearizzato purificato mediante metodi di laboratorio può essere esente da RNasi, proteine, RNA e sali contaminanti.

     Modelli PCR: I prodotti della PCR contenenti il ​​promotore della polimerasi T7 RNA nell'orientamento corretto possono essere trascritti.Si otterranno rese migliori con prodotti di PCR purificati, sebbene le miscele di PCR possano essere utilizzate direttamente.

    •Sintetico DNA oligonoucleotidi:Possono essere trascritti oligonucleotidi di DNA sintetico che sono interamente a doppio filamento o per lo più a singolo filamento con una sequenza promotrice T7 a doppio filamento

    Protocolli di sintesi dell'RNA

    Si consiglia vivamente di indossare guanti e di utilizzare provette e reagenti privi di nucleasi per evitare la contaminazione da RNasi.Le reazioni di piccolo volume devono essere assemblate in provette per microcentrifuga prive di nucleasi o provette per strip PCR.

    Sintesi convenzionale dell'RNA

    1.Scongelare i componenti necessari del kit, miscelarli e centrifugarli nella microcentrifuga per raccogliere le soluzioni sul fondo delle provette.Tieni il ghiaccio.

    2.Se si prevede di eseguire molte reazioni, è conveniente preparare una master mix combinando volumi uguali di 10× Hi-Yield IVT Buffer e quattro soluzioni di ribonucleotide (NTP).Utilizzare 10 µl di master mix per reazione.

    3. Assemblare la reazione a temperatura ambiente nel seguente ordine:

    Reagente

    Quantità

    Acqua priva di nucleasi

    X µl

    10 × buffer IVT ad alto rendimento A

    2μL

    ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM ciascuno)

    2 μL ciascuno (10 mM ciascuno finale)

    DNA modello

    YμL (1μg)

    Miscela di enzimi (termostabile)

    2μL

    Volume totale della reazione

    20 µl

    * Per ridurre l'immunogenicità del prodotto, l'UTP può essere sostituito da N1-Me-pUTP alla stessa concentrazione finale.

    4. Miscelare accuratamente e centrifugare a impulsi nella microcentrifuga.Incubare a 37°C per 2 ore o a 50°C per 1 ora se è necessaria una reazione ad alta temperatura.

    5. Digestione del DNA: per rimuovere il DNA modello, aggiungere 10U di DNasi I a ciascuna reazione da 20 μL, mescolare bene e incubare a 37°C per 30 minuti.

     

    Sintesi di RNA tappato

    Protocollo simile alla sintesi convenzionale dell'RNA, ad eccezione della fase di assemblaggio della reazione.Assemblare la reazione di sintesi dell'RNA tappato a temperatura ambiente nel seguente ordine:

    Reagente

    Quantità

    Acqua priva di nucleasi

    X µl

    10 × buffer IVT ad alto rendimento A

    2μL

    ATP/CTP/GTP/UTP *(100 mM ciascuno)

    2 μL ciascuno (10 mM ciascuno Finale)

    Analogo del cappuccio (100 mM)

    1,6 µl

    DNA modello

    YμL (1μg)

    Miscela di enzimi (termostabile)

    2μL

    Volume totale della reazione

    20 µl

    *** Se richiesto, Cap1(3'OH AG) e cap1(3'OMe AG) possono essere utilizzati come analoghi del cappuccio.Raccomandiamo il nostro reagente di co-trascrizione Reagente di trascrizione invitro Co-capping T7 (pUTP, CAP GAG (3'OMe), pUTP, CAP GAG, N1-Me-pUTP, CAP GAG (3'OMe) e N1-Me-pUTP, CAP BAVAGLIO.

     

    Purificazione dell'mRNA

    • Fenolo: Cloroformio extraazione ed etanolo Precipitazione

    Per la rimozione delle proteine ​​e della maggior parte dei nucleotidi liberi, il metodo preferito è l'estrazione con fenolo: cloroformio e la precipitazione con etanolo delle trascrizioni di RNA.

    1.Regolare il volume di reazione a 180 μL aggiungendo 160 μL di acqua priva di nucleasi.Aggiungere 20 μL di acetato di sodio 3M, pH 5,2, mescolare accuratamente.

    2. Estrarre con un volume uguale di miscela fenolo/cloroformio 1:1, centrifugare a 10.000 giri/min per 5 minuti.Raccogliere la fase acquosa e trasferirla in una nuova provetta.

    3. Seguite da due estrazioni con un uguale volume di cloroformio.Raccogliere la fase acquosa e trasferirla in una nuova provetta.

    4. L'RNA è stato precipitato con 2 volumi di etanolo.Incubare a -20℃ per almeno 30 minuti e raccogliere il pallet mediante centrifugazione per 15 minuti.Rimuovere con attenzione il surnatante.

    5. Sciacquare il pallet con 150 μL~200 μL di etanolo freddo al 70%.

    6. Asciugare il pallet all'aria per 2 minuti e risospendere in 100 μL~200 μL di acqua priva di RNasi o altri tamponi.

     

    • Precipitazione di LiCl

    La precipitazione dell'RNA con LiCl è efficace nel rimuovere la maggior parte degli NTP e degli enzimi non incorporati.

    1. Aggiungere un volume uguale di soluzione LiCl (5M), mescolare bene.

    2. Incubare a -20℃ per almeno 30 minuti.Centrifugare a 4℃ a 12.000 giri/min per 15 minuti per trasferire l'RNA su pallet.Rimuovere con attenzione il surnatante.

    3. Resinare il pallet aggiungendo 200 μL di etanolo al 70% preraffreddato.Rimuovere con attenzione l'etanolo.Ripetere i passaggi per 2~3 volte.

    4. Asciugare il pallet all'aria per 5~10 minuti e risospendere in 100 μL~200 μL di acqua priva di RNasi o altri tamponi.

    • Rotazione purificazione della colonna

    Le colonne rotanti rimuoveranno NTP, proteine ​​e sali non incorporati.

    • Puri con perline magneticheficazione

    La purificazione delle sfere magnetiche può rimuovere nucleotidi, proteine ​​e sali non incorporati.

     

    Quantificazione dei prodotti di reazione

    • Quantificazione da parte di UV assorbimento della luce: I prodotti di reazione necessitano di purificazione perché eventuali nucleotidi non incorporati e DNA modello nelle miscele di reazione influenzeranno la lettura.Misurando la spettrofotometria UV a 260 nm è possibile ottenere facilmente la concentrazione di RNA.Per l'RNA a filamento singolo, 1 A260 corrisponde a una concentrazione di RNA di 40 μg/mL.

     Quantificazione by tintura: La quantificazione dei prodotti di reazione può essere utilizzata con il colorante Ribogreen senza purificazione poiché i nucleotidi non incorporati non influiscono sulla valutazione dei prodotti di RNA.

      

    Appunti

    • La reazione di trascrizione deve essere eseguita in un ambiente privo di RNasi.È consigliabile indossare i guanti.I puntali, i tubi e l'acqua devono essere privi di nucleasi.

    • Tutta la concentrazione finale ottimale di NTP è 10 mM ed è possibile modificare la concentrazione finale di NTP in base allo stato attuale.

    • La miscela di reazione per la sintesi dell'RNA deve essere preparata a temperatura ambiente, poiché il DNA può precipitare in presenza di spermidina a 4°C.

    • La resa delle trascrizioni di lunghezza adeguata diminuisce se il DNA modello è linearizzato in modo incompleto.

    • La miscela di reazione può essere aumentata o ridotta.

    • Mescolare il tampone fino a completa dissoluzione delle sostanze insolubili prima dell'uso, se si riscontra che il tampone contiene sostanze insolubili dopo la rifusione.

    • Per reazioni con trascrizioni inferiori a 300 bp, un'incubazione di 4-8 ore a 37 ℃ dovrebbe fornire una resa maggiore.

    • Il modello di DNA utilizzato per le trascrizioni di sintesi dell'RNA standard deve contenere una sequenza del promotore T7 seguita dalla sequenza di inizio GGG, poiché la RNA polimerasi T7 ha un'affinità maggiore per il GTP.

    • Il modello di DNA utilizzato per la sintesi dell'mRNA con sistema di co-trascrizione deve contenere una sequenza promotrice T7 seguita dalla sequenza di inizio AGG.

    Risoluzione dei problemi

    a) Bassa resa della lente interagth RNA:

    Se la reazione di trascrizione genera RNA a lunghezza intera, ma la resa è significativamente inferiore al previsto, è possibile che i contaminanti nello stampo di DNA inibiscano la RNA polimerasi oppure la concentrazione di DNA potrebbe essere troppo bassa o errata.

    Suggerimento: Si consiglia un'ulteriore purificazione del modello di DNA.

     

    b) RNA trascrizione spalmandosi denaturante Gel:

    Se l'RNA appare degradato durante la denaturazione del gel di agarosio o di poliacrilammide, il modello di DNA o il processo dell'esperimento sono contaminati da RNasi.

    Suggerimento: Se il modello di DNA plasmidico è contaminato da RNasi, eseguire l'estrazione con fenolo/cloroformio e precipitare con etanolo.Assicurarsi che le punte e le provette utilizzate durante l'esperimento siano prive di RNasi.Si prega di indossare camice da laboratorio, maschera e guanti monouso.

     

    c)RNA trascrizione di dimensioni maggiori del previsto:

    Se la trascrizione dell'RNA appare più grande del previsto su un gel denaturante, il DNA plasmidico modello potrebbe essere digerito in modo incompleto.La presenza di forti strutture secondarie può far sì che il trascritto dell'RNA non sia completamente denaturato.

    Suggerimento: controllare il modello per la digestione completa, se viene confermato il plasmide non digerito, ripetere la digestione con enzimi di restrizione.Ridurre le strutture secondarie del modello di DNA nella fase di progettazione della sequenza.

     

    d) RNA trascrizione Di più piccola misurare di previsto:

    Se l'analisi del gel denaturante mostra la presenza di bande più piccole rispetto alla dimensione prevista, è molto probabile che ciò sia dovuto alla terminazione prematura da parte della polimerasi.Alcune sequenze che assomigliano ai segnali di terminazione della T7 RNA polimerasi causeranno la terminazione prematura.

    Suggerimento: l'incubazione della reazione di trascrizione a temperature più basse, ad esempio a 30°C, può aumentare la proporzione della trascrizione completa, tuttavia la resa sarà ridotta.Per i modelli ricchi di GC o i modelli con strutture secondarie, l'incubazione a 42°C può migliorare la resa della trascrizione a lunghezza intera.

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