2×Sensi Direct Premix-UNG (sonda qPCR)
N. cat.: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) è progettato per eseguire la PCR direttamente dai campioni senza estrazione del DNA o preparazione del campione.Questo reagente è costituito da DNA polimerasi hot-start, uracile DNA glicosilasi (UNG), inibitore della RNasi, MgCl2, dNTP (con dUTP invece di dTTP) e stabilizzatori per PCR quantitativa (qPCR).Questo reagente presenta un'elevata tolleranza agli inibitori e quindi può essere applicato direttamente al rilevamento di campioni come tampone faringeo, saliva, sangue intero anticoagulato, plasma e siero senza estrazione del DNA.Il reagente utilizza un tampone proprietario per qPCR con enzimi misti di DNA polimerasi anti-inibitoria e enzima UNG.Pertanto, può ottenere una buona amplificazione dei geni bersaglio in campioni contenenti inibitori e inibire l'amplificazione dei falsi positivi causata dai residui della PCR e dall'inquinamento da aerosol.Questo reagente è compatibile con la maggior parte degli strumenti PCR quantitativi fluorescenti, come Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche e così via.
Componenti
1. 50×Miscela di enzimi SensiDirect/UNG
2. 2×buffer premiscelato SensiDirect (dUTP)
Condizioni di archiviazione
Tutti i componenti devono essere conservati a -20 ℃ per la conservazione a lungo termine e a 4 ℃ per un massimo di 3 mesi.Si prega di mescolare accuratamente dopo lo scongelamento e di centrifugare prima dell'uso.Evitare frequenti fenomeni di congelamento-scongelamento.
Protocollo ciclistico
| Fare un passo | Temperatura | Tempo | Ciclo |
| Digestione | 50℃ | 2 minuti | 1 |
| Attivazione della polimerasi | 95 ℃ | 1-5 minuti | 1 |
| Denaturare | 95 ℃ | 10-20 secondi | 40-50 |
| Ricottura/Estensione | 56-64℃ | 20-60 |
Istruzioni per il pipettaggio
| Reagente | Volume per reazione | Volume per reazione | Concentrazione finale |
| 2×buffer premiscelato SensiDirect (dUTP) | 12,5 µl | 25 µl | 1× |
| 50×Miscela di enzimi/UNG SensiDirect | 0,5 µl | 1 µl | 1× |
| 25×Miscela primer-sonda1, 2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| Campione3, 4 | - | - | - |
| DDH2O | - | - | - |
| Volume totale | 25 µl | 50 µl | - |
1. La concentrazione finale del primer è solitamente 0,2μM.Per risultati migliori, la concentrazione del primer può essere ottimizzata nell'intervallo 0,2-1μM.
2. In generale, la concentrazione della sonda può essere ottimizzata nell'intervallo 0,1-0,3μM.La concentrazione ottimale della sonda dipende dallo strumento di amplificazione PCR in tempo reale, dal tipo di sonda e dal tipo di sostanza marcante fluorescente.Fare riferimento al manuale dello strumento o ai requisiti specifici di ciascuna sonda fluorescente.
3. Diversi tipi di campioni contengono diversi tipi e contenuti di inibitori e numero di copie del gene bersaglio.Il volume del campione deve essere considerato in base alle condizioni effettive.Diluire il campione aggiungendo acqua priva di nucleasi o tampone TE, se necessario.
4. Volume consigliato di diversi campioni:
| Campione | Volume per uno 50 μL reazione | Massimo rapporto |
| Sangue intero anticoagulato | 2,5 µl | 5% |
| Plasma | 15 µl | 30% |
| Siero | 10 µl | 20% |
| Tampone faringeo | 10 µl | 20% |
| Saliva | 10 µl | 20% |
Controllo di qualità
1. Rilevazione della funzione: sensibilità, specificità e ripetibilità della qPCR.
2. Nessuna attività nucleasica esogena: nessun inquinamento da endonucleasi ed esonucleasi esogena.
Note del prodotto
1. Questo prodotto utilizza un nuovo tipo di DNA polimerasi hot-start, che può essere attivato in 1-5 minuti. Poiché il suo tampone di reazione è stato ottimizzato, è più adatto per la PCR quantitativa a fluorescenza doppia o multipla utilizzando il metodo con sonda.
2. Se il valore Rn dell'amplificazione PCR è troppo basso o l'amplificazione è chiaramente inibita, diminuendo la quantità di campione, aumentando il volume di reazione o previa diluizione del campione è possibile migliorare i risultati.
3. La raccolta di sangue, saliva, urina, tampone faringeo, ecc. deve seguire i requisiti dei criteri clinici e può essere utilizzato un campione fresco per prevenire la degradazione dell'acido nucleico.
4. Poiché ampliconi diversi hanno efficienza di utilizzo rispetto a dUTP e sensibilità a UNG differenti, i reagenti devono essere ottimizzati se la sensibilità di rilevamento diminuisce quando si utilizza il sistema UNG.Vi preghiamo di contattarci per supporto tecnico, se necessario.
5. Per evitare l'amplificazione dei prodotti di carryover della PCR tra reazioni one-step, sono necessarie un'area sperimentale e una pipetta dedicate per l'amplificazione.Operare con i guanti e cambiarli frequentemente e non aprire la provetta di reazione dopo l'amplificazione PCR.
