Premix universale SYBR GREEN qPCR (blu)

N. cat.: HCB5041B

Universal Blue qPCR Master Mix (a base di coloranti) è una pre-soluzione per l'amplificazione PCR quantitativa 2×real-time caratterizzata da elevata sensibilità e specificità, è di colore blu e ha l'effetto di tracciare l'aggiunta del campione.Il componente principale della Taq DNA polimerasi utilizza l'hot start dell'anticorpo per inibire efficacemente l'amplificazione non specifica dovuta alla ricottura del primer durante la preparazione del campione.Allo stesso tempo, la formula aggiunge i fattori promotori per migliorare l'efficienza di amplificazione della reazione PCR e equalizzare l'amplificazione dei geni con diversi contenuti GC (30 ~ 70%), in modo che la PCR quantitativa possa ottenere una buona relazione lineare in un ampio spettro quantitativo regione.Questo prodotto contiene uno speciale colorante di riferimento passivo ROX, applicabile alla maggior parte degli strumenti qPCR.Non è necessario regolare la concentrazione di ROX su strumenti diversi.È solo necessario aggiungere primer e templati per preparare il sistema di reazione per l'amplificazione.

Componenti

Miscela master universale qPCR blu

Condizioni di archiviazione

Il prodotto viene spedito con impacchi di ghiaccio e può essere conservato a -25℃~-15℃ per 18 mesi.È necessario evitare una forte irradiazione luminosa durante la conservazione o la preparazione del sistema di reazione.

Specifica

Istruzioni

1.Sistema di reazione

[Nota]: mescolare accuratamente prima dell'uso per evitare bolle eccessive dovute a un'agitazione vigorosa.

a) Concentrazione del primer: la concentrazione finale del primer è 0,2μmol/L e può anche essere regolata tra 0,1 e 1,0μmol/L, a seconda dei casi.

b) Concentrazione del modello: se il modello è una soluzione madre di cDNA non diluita, il volume utilizzato non deve superare 1/10 del volume totale della reazione qPCR.

c) Diluizione del modello: si consiglia di diluire la soluzione madre di cDNA di 5-10 volte.La quantità ottimale di templato aggiunto è migliore quando il valore Ct ottenuto mediante amplificazione è di 20-30 cicli.

d) Sistema di reazione: si consiglia di utilizzare 20μL o 50μL per garantire l'efficacia e la ripetibilità dell'amplificazione del gene target.

e) Preparazione del sistema: prepararsi nel banco super pulito e utilizzare puntali e provette di reazione senza residui di nucleasi;si consiglia di utilizzare i puntali con cartucce filtranti.Evitare la contaminazione incrociata e la contaminazione da aerosol.

2.Programma di reazione

Programma standard

Programma veloce

[Nota]: il programma veloce è adatto alla stragrande maggioranza dei geni, mentre i programmi standard possono essere provati per singoli geni della struttura secondaria complessa.

a) Temperatura e tempo di ricottura: regolare in base alla lunghezza del primer e del gene target.

b) Acquisizione del segnale di fluorescenza (★): impostare la procedura sperimentale in base ai requisiti contenuti nelle istruzioni per l'uso dello strumento.

c) Curva di fusione: il programma predefinito dello strumento può essere utilizzato normalmente.

3. Analisi dei risultati 

Per gli esperimenti quantitativi erano necessarie almeno tre repliche biologiche.Dopo la reazione, è necessario confermare la curva di amplificazione e la curva di fusione.

3.1 Curva di amplificazione:

La curva di amplificazione standard è a forma di S.L'analisi quantitativa è più accurata quando il valore Ct è compreso tra 20 e 30. Se il valore Ct è inferiore a 10, è necessario diluire il templato ed eseguire nuovamente il test.Quando il valore Ct è compreso tra 30 e 35, è necessario aumentare la concentrazione del templato o il volume del sistema di reazione, in modo da migliorare l'efficienza dell'amplificazione e garantire l'accuratezza dell'analisi dei risultati.Quando il valore Ct è maggiore di 35, i risultati del test non possono analizzare quantitativamente l'espressione del gene, ma possono essere utilizzati per l'analisi qualitativa.

3.2 Curva di fusione:

Il singolo picco della curva di fusione indica che la specificità della reazione è buona ed è possibile eseguire l'analisi quantitativa;se la curva di fusione presenta picchi doppi o multipli non è possibile eseguire l'analisi quantitativa.La curva di fusione mostra picchi doppi ed è necessario giudicare se il picco non target è un dimero di primer o un'amplificazione non specifica mediante elettroforesi su gel di agarosio del DNA.Se si tratta di un dimero di primer, si consiglia di ridurre la concentrazione di primer o di riprogettare i primer con un'elevata efficienza di amplificazione.Se si tratta di un'amplificazione non specifica, aumentare la temperatura di ricottura o riprogettare i primer con specificità.

Appunti

Si prega di indossare i DPI necessari, come camice da laboratorio e guanti, per garantire la propria salute e sicurezza!

Questo prodotto è SOLO per uso di ricerca!