KIT ELISA per RNA a doppio filamento (dsRNA).

Questo kit è un test immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) che si accoppia con il sistema biotina-streptavidina, per la misurazione quantitativa di dsRNA con lunghezza superiore a 60 paia di basi (bp), indipendentemente dalla sequenza.La piastra è stata prerivestita con anticorpo anti-dsRNA.Il dsRNA presente nel campione viene aggiunto e si lega agli anticorpi rivestiti sui pozzetti.Quindi viene aggiunto l'anticorpo anti-dsRNA biotinilato che si lega al dsRNA nel campione.Dopo il lavaggio, viene aggiunta la streptavidina HRP che si lega all'anticorpo anti-dsRNA biotinilato.Dopo l'incubazione la HRP-streptavidina non legata viene lavata via.Quindi la soluzione di substrato TMB viene aggiunta e catalizzata da HRP per produrre un prodotto di colore blu che diventa giallo dopo l'aggiunta della soluzione di arresto acida.La densità del giallo è proporzionale alla quantità target di dsRNA catturato nella piastra.L'assorbanza viene misurata a 450 nm.

Applicazione

Questo kit serve per la misurazione quantitativa del dsRNA residuo.

Componenti del kit

Conservazione e stabilità

1. Per il kit non utilizzato: l'intero kit può essere conservato a 2~8℃ durante il periodo di validità.La luce forte dovrebbe essere evitata per garantire la stabilità dello stoccaggio.

2. Per il kit usato: una volta aperta la micropiastra, coprire i pozzetti non utilizzati con il sigillante per piastre e riporli nella busta di alluminio contenente la confezione di essiccante, sigillare con cerniera la busta di alluminio e riporla a 2~8℃ il prima possibile dopo l'uso.Gli altri reagenti devono essere riportati a 2~8℃ il prima possibile dopo l'uso.

Materiali richiesti ma non forniti

1. Lettore di micropiastre con filtro da 450±10 nm (meglio se in grado di rilevare a 450 e 650 nm di lunghezza d'onda).

2. Agitatore per micropiastre.

3. Puntali e provette da centrifuga privi di RNasi.

Diagramma di flusso dell'operazione

Prima di iniziare

1. Portare tutti i componenti del kit e i campioni a temperatura ambiente (18-25℃) prima dell'uso.Se il kit non verrà utilizzato in una sola volta, estrarre solo le strisce e i reagenti per l'esperimento in corso e lasciare le strisce e i reagenti rimanenti nelle condizioni richieste.

2. Tampone di lavaggio: diluire 40 ml di tampone di lavaggio concentrato 20× con 760 ml di acqua deionizzata o distillata per preparare 800 ml di tampone di lavaggio 1×.

3. Standard: centrifugare o centrifugare brevemente la soluzione madre prima dell'uso.La concentrazione dei quattro standard forniti è 5 ng/μL.Per gli standard dsRNA UTP e pUTP, diluire la soluzione madre a 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL con tampone STE per tracciare la curva standard.Per gli standard dsRNA N1-Me-pUTP, diluire la soluzione madre a 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL con tampone STE per disegnare la curva standard.Per lo standard dsRNA 5-OMe-UTP, diluire la soluzione madre a 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL con tampone STE per disegnare la curva standard.Raccomandiamo che gli standard possano essere diluiti come nelle seguenti tabelle:

4. Soluzione di lavoro dell'anticorpo di rilevamento biotinilato e della streptavidina HRP: centrifugare o centrifugare brevemente la soluzione madre prima dell'uso.Diluirli alla concentrazione di lavoro con tampone di diluizione.

5. Sottostato TMB: aspirare la dose necessaria di soluzione con punte sterilizzate e non versare nuovamente la soluzione residua nella fiala.Il substrato TMB è sensibile alla luce, non esporre il substrato TMB alla luce per lungo tempo.

Utilizzando il protocollo

1. Determinare il numero di strisce necessarie per il test.Inserire le strisce nei telai per l'uso.Le strisce rimanenti della piastra non utilizzate in questo test devono essere reimballate nella busta con essiccante.Chiudere bene la borsa per la conservazione in frigorifero.

2. Aggiungere 100μL di ciascuna diluizione di standard, bianco e campioni nei pozzetti appropriati.Coprire con la pellicola sigillante.Incubare per 1 ora a temperatura ambiente agitando a 500 giri/min.I campioni devono essere diluiti con tampone STE alla concentrazione appropriata per un test accurato.

3. Fase di lavaggio: aspirare la soluzione e lavare con 250μL di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto e lasciare riposare per 30 secondi.Eliminare completamente il tampone di lavaggio facendo scattare la piastra su carta assorbente.Lavare completamente 4 volte.

4. Aggiungere 100μL di soluzione di lavoro di anticorpi di rilevamento biotinilati in ciascun pozzetto.Coprire con la pellicola sigillante.Incubare per 1 ora a temperatura ambiente agitando a 500 giri/min.

5. Ripetere la fase di lavaggio.

6. Aggiungere 100μL di soluzione di lavoro HRP-streptavidina in ciascun pozzetto.Coprire con la pellicola sigillante.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente agitando a 500 giri/min.

7. Ripetere nuovamente la fase di lavaggio.

8. Aggiungere 100μL di soluzione substrato TMB in ciascun pozzetto.Coprire con il sigillante per piastre.Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce.Il liquido diventerà blu con l'aggiunta della soluzione substrato.

9. Aggiungere 50μL di soluzione bloccante in ciascun pozzetto.Il liquido diventerà giallo con l'aggiunta della soluzione bloccante.Quindi avviare il lettore di micropiastre ed eseguire immediatamente la misurazione a 450 nm.

Calcolo dei risultati

1. Calcolare la media delle letture duplicate per ciascuno standard, controllo e campione e sottrarre la densità ottica media dello standard pari a zero.Costruire una curva standard con l'assorbanza sull'asse verticale (Y) e la concentrazione di dsRNA sull'asse orizzontale (X）.

2. Si consiglia di eseguire il calcolo con un software di adattamento della curva basato su computer come Curve Expert 1.3 o ELISA Calc in un modello di adattamento non lineare a 5 o 4 parametri.

Prestazione

1. Sensibilità:

limite inferiore di rilevamento: ≤ 0,001pg/μL (per UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (per 5-OMe-UTP-dsRNA).

limite inferiore di quantificazione: 0,0156 pg/μL (per UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (per N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (per 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precisione: CV intra-test ≤10%, CV inter-test ≤10%

3. Recupero: 80%~120%

4. Linearità: 0,0156-0,5 pg/μL (per UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/μL (per N1-Me-pUTP dsRNA), 0,0625-1 pg/μL (per 5-OMe-UTP-dsRNA).

Considerazioni

1. La temperatura e il tempo di reazione del TMB sono fondamentali, controllarli rigorosamente secondo le istruzioni.

2. Per ottenere una buona riproducibilità e sensibilità del test, è essenziale un lavaggio adeguato delle piastre per rimuovere i reagenti non reagiti in eccesso.

3. Tutti i reagenti devono essere miscelati accuratamente prima dell'uso ed evitare urti durante l'aggiunta del campione o dei reagenti.

4. Se si sono formati cristalli nel tampone di lavaggio concentrato (20x), riscaldare a 37 ℃ e mescolare delicatamente fino a quando i cristalli non sono completamente sciolti.

5. Evitare l'analisi di campioni contenenti sodio azide (NaN3), poiché potrebbe distruggere l'attività dell'HRP con conseguente sottostima della quantità di dsRNA.

6. Evitare la contaminazione da RNasi durante l'analisi.

7. Lo standard/campione, l'anticorpo di rilevamento e SA-HRP possono anche essere condotti a temperatura ambiente senza agitazione, ma ciò potrebbe causare una diminuzione della sensibilità di rilevamento di una volta.Per questo caso, si consiglia di diluire gli standard dsRNA UTP e pUTP a partire da 2pg/μL, gli standard dsRNA N1-Me-pUTP a partire da 4pg/μL e lo standard dsRNA 5-OMe-UTP a partire da 8pg/μL.Inoltre, incubare la soluzione di lavoro HRP-streptavidina per 60 minuti a temperatura ambiente.Non utilizzare l'agitatore per matracce, perché l'agitatore per matracce potrebbe produrre risultati imprecisi.

Risultato tipico

1. Dati della curva standard

2. Calcolo della curva standard

3. Intervallo di rilevamento del rivestimento: 0,0312-1 pg/μL