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Immagine in evidenza della RNA polimerasi T7 HCP1011A
  • T7 RNA polimerasi HCP1011A

T7 RNA polimerasi


N. cat.:HCP1011A

Confezione: 100μL/1 ml/10 ml/100 ml

La T7 RNA polimerasi è una RNA polimerasi DNA-dipendente del fago T7

Descrizione del prodotto

Dati del prodotto

La T7 RNA polimerasi è una RNA polimerasi DNA-dipendente del fago T7, che possiede un'attività forte e specifica della RNA polimerasi 5´→ 3´. La T7 RNA polimerasi ha un'elevata specificità per le sequenze del promotore T7 e sintetizzerà grandi quantità di RNA da un frammento di DNA inserito a valle di un promotore.


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  • Componenti

    T7 RNA polimerasi (50 U/μL)

    10 buffer HH T7

    Condizioni di archiviazione

    Trasporto a temperatura inferiore a 0°C e stoccaggio a -25 ~ - 15 °C.

    Specifica

    nome del prodotto

    T7 RNA polimerasi

    Caratterizzazione del prodotto

    Liquido chiaro

     

    Definizione dell'unità di attività

    Una unità è definita come la quantità di enzima

    che catalizzerà NTP per produrre 1 nmol PPi in

    1 ora a 37°C sotto il sistema di reazione standard.

    Buffer di archiviazione

    Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, β-M 20 mM, EDTA 1 mM, glicerolo al 50%, 0.1% (p/v)

    Triton® X-100, pH 7,9 a 25°C.

     

    Tampone 10×HH T7

    Tris-HCl 400 mM (25 ℃, pH 8,20), 60 mM

    MgCl2, 100 mM DTT, 20 mM spermidina.

    Condizioni di conservazione

    -25 ~ – 15℃, evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti

     

    Reazione e condizione

    Reazione convenzionale

    Reagente

    Quantità

    Acqua priva di nucleasi o acqua trattata con DEPC

    Fino a 20 µl

    10 buffer HH T7

    2μL

    ATP/GTP/CTP/UTP (100 mM ciascuno)

    0,4 μL ciascuno (2 mMeach finale)

    Inibitore della RNasi (40 U/μL)(opzionale)

    1μL (40 U)

    Pirofosfatasi inorganica(opzionale)

    0,5μL (0,05U)

    T7 RNA polimerasi(50 U/μL)

    1 ml

    Modello di DNA linearizzato

    1 mg

    Aggiungere i componenti di reazione nell'ordine sopra * 10 × HH T7 Buffer è adatto solo per NTP da 2 mM, altri kit di trascrizione T7 ad alto rendimento sono consigliati per NTP da 7,5 mM a 10 mM.

    Tempo di incubazione:37°C per 2 ore.

    Stop di reazione: Aggiungere 2μL di EDTA 0,2 M (pH8,0 a 25℃) o riscaldare a 75 °C per 10 minuti.

    Rimozione del DNA: Il modello di DNA può essere rimosso con 2U DNasi I (RNasi-free) e incubato per 15 minuti a 37°.

     

    Controllo di qualità

    Attività dell'endonucleasi: L'incubazione di una reazione da 50μL contenente un minimo di 50U di T7 RNApolimerasi con 1 μg di λDNA per 16 ore a 37 ℃ non ha prodotto alcuna degradazione rilevabile come determinato.

    Attività di esonucleasi: L'incubazione di una reazione da 50μL contenente un minimo di 50U di T7 RNA polimerasi con 1 μg di DNA digerito λ -Hind Ⅲ per 16 ore a 37°C non ha prodotto alcuna degradazione rilevabile come determinato.

    Nickase Attività: L'incubazione di una reazione da 50μL contenente un minimo di 50U di T7 RNA polimerasi con 1μg di DNA pBR322 per 16 ore a 37°C non ha prodotto alcuna degradazione rilevabile come determinato.

    RNasi Attività: L'incubazione di una reazione da 50μL contenente un minimo di 50U di T7 RNA polimerasi con 1,6μg di RNA MS2 per 16 ore a 37°C non ha prodotto alcuna degradazione rilevabile come determinato.

    Inattivazione del calore: 75°C per 10 min.

     

    Precauzione

    • La reazione di trascrizione deve essere eseguita in un ambiente privo di contaminazione da RNasi.È consigliabile indossare i guanti.I puntali, i tubi e l'acqua devono essere privi di nucleasi.

    • La resa produttiva dell'RNA può essere migliorata aumentando la concentrazione di NTP (ogni concentrazione può raggiungere 10 mM), mentre la concentrazione di Mg2+ deve essere opportunamente aumentata.

    • La miscela di reazione per la sintesi dell'RNA deve essere preparata a temperatura ambiente, poiché il DNA può precipitare in presenza di tampone 10×HH T7 a 4°C.

    •La resa delle trascrizioni di lunghezza adeguata diminuisce se il DNA modello è linearizzato in modo incompleto.•La miscela di reazione può essere aumentata o ridotta.• Se la resa del prodotto di reazione diminuisce, è possibile aggiungere 20 mM di DTT fresco al sistema di reazione.

    • I frammenti trascritti sono inferiori o uguali a 500 bp e si consiglia di estendere il tempo di trascrizione a 4-8 ore.

    •I precipitati sono facili da trovare in 10×HH T7.

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