mRNA Cap2'-O-metiltransferasi

L'mRNA Cap 2'-O-metiltransferasi è stato derivato da un ceppo ricombinante di E. coli che trasporta il gene per l'mRNA Cap 2'-O-metiltransferasi del vaccino.Questo enzima aggiunge un gruppo metilico nella posizione 2'-O del primo nucleotide adiacente alla struttura del cappuccio all'estremità 5' dell'RNA. L'enzima utilizza la S-adenosilmetionina (SAM) come donatore di metile per metilare l'RNA bloccato (cap -0) risultando in una struttura cap-1.

La struttura Cap1 può aumentare l'efficienza della traduzione, migliorando l'espressione dell'mRNA negli esperimenti di trasfezione e microiniezione. Questo enzima richiede specificamente RNA con un cap m7GpppN come substrato.Non può utilizzare RNA con pN, ppN, pppN o GpppN all'estremità 5'.L'RNA tappato può essere preparato tramite trascrizione in vitro utilizzando l'analogo del tappo o tramite tappatura enzimatica utilizzando l'enzima di tappatura del vaccino.

Componenti

mRNA Cap 2´-O-metiltransferasi (50U/μL)

10×Tampone di reazione di tappatura

Magazzinaggio

-25 ～- 15 ℃ per la conservazione (Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento)

Buffer di archiviazione

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0, 25 ℃), NaCl 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 0,1%, 50% glicerolo.

Definizione di unità

Una unità è definita come la quantità di enzima richiesta per metilare 10 pmoli di trascritto di RNA tappato da 80 nt in 1 ora a 37°C.

Saggi di controllo qualità

Esonucleasi:50U di mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferasi con 1μg di DNA digerito di λ-Hind III a 37 ℃ per 16 ore non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Endonucleasi: 50 U di mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferasi con 1 μg di λDNA a 37 ℃ per 16 ore non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Nickase: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferasi con 1μg di pBR322 a 37 ℃ per 16 ore non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

RNasi: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferasi con 1,6μg di RNA MS2 per 4 ore a 37°C non producono alcuna degradazione, come determinato mediante elettroforesi su gel di agarosio.

E. coli DNA: 50U di mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferasi vengono esaminati per la presenza diE. coli DNA genomico utilizzando TaqMan qPCR con primer specifici per ilE. coli Locus dell'rRNA 16S.ILE. coli la contaminazione del DNA genomico è =1E. coli genoma.

Batterico Endotossina: LAL-test, secondo la Farmacopea Cinese IV edizione 2020, metodo del test del limite del gel, regola generale (1143).Il contenuto di endotossine batteriche dovrebbe essere = 10 EU/mg.

Sistema e condizioni di reazione

1. Combinare una quantità adeguata di RNA tappato e H2O priva di RNasi in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL fino a un volume finale di 16,0 µL.

2. Riscaldare a 65 ℃ per 5 minuti seguito da un bagno di ghiaccio per 5 minuti.

3. Aggiungere i seguenti componenti nell'ordine specificato (per la metilazione dell'RNA capped

meno di 10

*10× Tampone di reazione di tappatura: Tris-HCl 500 mM (pH 8,0, 25 ℃), KCl 50 mM, MgCl2 10 mM 、 DTT 10 mM.

4. Incubare a 37℃ per 1 ora (si consigliano 2 ore di incubazione per il frammento target inferiore a 200 nt).

Applicazioni

Per migliorare l'espressione dell'mRNA durante gli esperimenti di microiniezione e trasfezione.

Note sull'uso

1. Prima della reazione, l'RNA deve essere purificato e sciolto in acqua priva di nucleasi, tutte le soluzioni non devono contenere EDTA e ioni.

2. Si consiglia di riscaldare l'RNA del campione a 65℃ per 5 minuti prima della reazione per rimuovere la struttura secondaria sull'estremità 5' del trascritto.Potrebbe essere esteso a 10 minuti per la struttura complessa a 5'-terminali.