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Kit di analisi della RNAsi (fluorescenza) HCP0035A Immagine in evidenza
  • Kit di analisi della RNAsi (fluorescenza) HCP0035A

Kit di analisi della RNAsi (fluorescenza)


N. cat.:HCP0035A

Confezione: 48T/96T

Il kit di rilevamento dell'RNasi si basa su una sonda di RNA marcata con fluoroforo.

Descrizione del prodotto

Dati del prodotto

Il kit di rilevamento dell'RNasi si basa su una sonda di RNA marcata con fluoroforo.Quando il campione non contiene attività RNasi, la sonda è stabile e non produce un segnale fluorescente;quando il campione contiene attività RNasi, la sonda viene degradata, determinando un segnale di fluorescenza gradualmente potenziato;la velocità di aumento del segnale di fluorescenza è positivamente correlata al numero e all'attività degli enzimi.Utilizzare un lettore di micropiastre a fluorescenza per misurare alla lunghezza d'onda ex/em=535/575 nm per determinare se il campione è contaminato da RNasi.


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  • Applicazione

    Questo kit viene utilizzato per rilevare la contaminazione da RNasi nei campioni.

     

    Ccomponenti

    Nome

    HCP0035A-01

    (192T)

    HCP0035A-02

    (48T)

    Soluzione di reazione 10×

    2,0 ml

    0,5 ml

    Sonda dell'RNA

    1 tubo

    1 tubo

    Tampone TE

    2,0 ml

    0,5 ml

    Standard RNasi A (10 mg/ml)

    20μL

    10μL

    Tampone di diluizione standard

    12 ml

    6 ml

    Acqua priva di DNasi e RNasi

    25 ml

    25 ml

    DNasi RNasi via

    50 ml

    50 ml

     

    Conservazione e stabilità

    1. Trasportato a -25 ~ – 15 ℃;

    2.I diversi componenti del kit vengono conservati separatamente in base alla temperatura:

    Nome

    temperatura

    Soluzione di reazione 10×

    -25 ~ – 15 ℃

    Sonda dell'RNA

    -25 ~ – 15 ℃

    Tampone TE

    -25 ~ – 15 ℃

    Standard RNasi A (10 mg/ml)

    -25 ~ – 15 ℃

    Tampone di diluizione standard

    -25 ~ – 15 ℃

    Acqua priva di DNasi e RNasi

    -25~30℃

    DNasi RNasi via

    2~30℃

    3. Conservare il kit non aperto per 12 mesi.

    4.Conservare il kit per 6 mesi dopo l'apertura.Si consiglia di suddividere in aliquote la soluzione della sonda RNA in base alla quantità monouso per evitare congelamenti e scongelamenti leggeri e ripetuti.

     

    Attrezzature e materiali di consumo necessari

    1.Lettore di micropiastre a fluorescenza (inclusa la lunghezza d'onda ex/em=535/575 nm)

    2. Pipette e puntali privi di DNasi e RNasi

    3. Tubo EP privo di DNasi e RNasi

    4. Piastra da 96 pozzetti nera non trasparente priva di DNasi e RNasi

    Preparazione dei reagenti

    1.Estrarre il kit e equilibrarlo a temperatura ambiente (18~25℃), agitare e miscelare i componenti come soluzione di reazione 10×, tampone TE, standard RNasi A (10 mg/mL), tampone di diluizione standard, quindi centrifugare immediatamente.(Centrifugare a 4.000~7.000 giri/min per 10 secondi).

     2. Centrifugare la sonda RNA a 4.000~7.000 giri/min per 60 secondi per raccoglierla sul fondo della provetta, aprire con attenzione il tappo della provetta e aggiungere 40μL di tampone TE da sciogliere come soluzione di conservazione della sonda RNA, aliquotare la soluzione di conservazione della sonda RNA secondo alla quantità monouso e conservarli a -25 ~ -15 °C per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.Estrarre la soluzione di conservazione della sonda ogni volta che si esegue il test, diluirla 50 volte con tampone TE (ad esempio, aggiungere 490μL di tampone TE in 12μL di sonda RNA) come soluzione di lavoro della sonda RNA.Conservare il resto della soluzione di lavoro della sonda RNA a -25 ~ -15 °C per evitare la luce e ripetuti congelamenti e scongelamenti.

     

    Passaggi di rilevamento

    1. Impostare il guadagno appropriato prima del primo test, per evitare il rischio di perdita di sensibilità o sovrasaturazione del segnale.

    1) parametri dello strumento:

    Scuotere la piastra per 10~15 secondi prima del rilevamento;

    Lunghezza d'onda di eccitazione λEx=535nm;

    Lunghezza d'onda di emissione λEm=575nm;

    Utilizzare la funzione di guadagno automatico;

    Temperatura 37℃;

    Modalità punto finale.

    Se possibile, impostare il guadagno su scala automatica, in alternativa utilizzare inizialmente un'impostazione di guadagno medio.

    Nota: il metodo di impostazione dei diversi strumenti non è coerente, consultare il fornitore dello strumento per i dettagli.

    2) Selezionare 2 pozzetti su una piastra da 96 pozzetti, aggiungere 10μL di soluzione di lavoro della sonda RNA e 10μL di soluzione di reazione 10× a ciascun pozzetto;

    3) Aggiungere 80μL di acqua priva di DNasi e RNasi in un pozzetto e aggiungere 79μL di acqua priva di DNasi e RNasi e 1μL di standard RNasi A (100 mg/ml) nell'altro pozzetto.

    4) Posizionare la piastra in un luogo buio a 37°C e testarla dopo 30 minuti.

    5) Se si imposta il guadagno su scala automatica, il valore del guadagno verrà visualizzato nella barra dei parametri dello strumento del file dati, indicato come G1.

    6) Quando si utilizza inizialmente un'impostazione di guadagno medio, è necessario notare che: se il valore di fluorescenza elevato supera il limite superiore dello strumento, il valore di guadagno deve essere opportunamente ridotto;se il valore di fluorescenza elevato è molto al di sotto del limite superiore dello strumento, il valore di guadagno dovrebbe essere opportunamente aumentato;Infine, si ottiene il valore di guadagno appropriato, indicato come G2.

    2.Simpostare i parametri dello strumento:

    Scuotere la piastra per 10~15 secondi prima del rilevamento;

    Lunghezza d'onda di eccitazione λEx=485nm;

    Lunghezza d'onda di emissione λEm=525nm;

    Impostare il valore del guadagno su G1 o G2 ottenuto nel passaggio 1;

    Temperatura 37℃;

    Se il lettore di micropiastre supporta la modalità cinetica, si consiglia di utilizzare la modalità di rilevamento cinetico, con un intervallo compreso tra 1 e 1,5 minuti e il tempo totale è di 30 minuti.

    3.preparazione del campione

    Il volume del campione consigliato è 80μL.Se il campione da analizzare è inferiore a 80μL, diluire a 80μL con acqua priva di DNasi&RNasi.

    Quando il campione da testare contiene sostanze che influenzano la luminescenza del fluoroforo (come soluzioni scure, sostanze viscose ad alta concentrazione o tensioattivi), il campione deve essere diluito con acqua priva di DNasi&RNasi, ma si tenga presente che l'operazione di diluizione influenzerà la sensibilità.Per il campione da analizzare che contiene inibitori dell'attività della RNasi (come soluzioni ad elevata forza ionica, tamponi pH<4 o pH>9, denaturanti proteici, ecc.), il risultato della misurazione è l'attività enzimatica complessiva della soluzione campione, non l'attività enzimatica complessiva della soluzione campione. attività individuale dell'enzima.

     

    Diluire lo standard DNasi I (10 mg/ml) con il tampone di diluizione standard come segue: 

    NO.

    processo di preparazione

    Concentrazione

    1

    2μL di standard RNasi A + 198μL di tampone di diluizione standard

    0,1 mg/ml

    2

    2μL di campione n. 1 + 198μL di tampone di diluizione standard

    1×10-3 mg/ml

    3

    2μL di campione n. 2 + 198μL di tampone di diluizione standard

    1×10-5 mg/ml

    4

    2μL di campione n. 3 + 198μL di tampone di diluizione standard

    1×10-7 mg/ml

    5

    100μL di campione n. 4 + 100μL di tampone di diluizione standard

    5×10-8 mg/ml

     Diluire il campione n. 5 con acqua priva di DNasi e RNasi per 10 volte:

    6

    20μL di campione n. 5 + 180μL di acqua priva di DNasi e RNasi

    5×10-9 mg/ml,

    5 pg/ml

    Il campione n. 6 viene utilizzato come controllo positivo;Come controllo negativo viene utilizzata acqua priva di DNasi e RNasi.

    4.Dosaggio e test

    1) Aggiungere 10μL della soluzione di lavoro della sonda RNA e 10μL della soluzione di reazione 10× alla piastra da 96 pozzetti.Selezionare 4 pozzetti per aggiungere rispettivamente il controllo negativo e il controllo positivo e gli altri pozzetti per aggiungere i campioni da testare.Sono presenti 2 pozzetti multipli per ciascun campione, 80μL per ciascun pozzetto;

    2) Testare e leggere immediatamente il valore del segnale di fluorescenza RFU0 per 0 minuti.Dopo essere stato posto al buio a 37 ℃ per 30 minuti, testare e leggere nuovamente il valore del segnale di fluorescenza RFU30 per 30 minuti.Se viene adottata la modalità dinamica, è possibile leggere tutti i segnali di fluorescenza per 0~30 minuti.

     

    Interpretazione dei risultati dei test

    Se RFU30≥2×RFU0, si considera che il campione da testare sia contaminato da RNasi.

    Nota: se il campione da analizzare è gravemente contaminato o contiene sostanze interferenti, può verificarsi che RFU0 (campione da analizzare) > RFU0 (controllo qualità positivo) e RFU30 (campione da analizzare) < 2 ×RFU0 (campione da analizzare testato), portando a un giudizio falso negativo.A questo punto, il campione da testare dovrà essere prediluito con acqua priva di DNasi e RNasi e quindi testato.

     

    Rilevazione quantitativa

    Quando il campione da testare è contaminato ed è necessario giudicare il valore di concentrazione di RNasi nel campione, è possibile determinarlo attraverso le seguenti procedure:

     

    Diluire lo standard RNasi A (10 mg/ml) con il tampone di diluizione standard come segue:

    NO.

    Processo di preparazione

    concentrazione

    1

    2μL di RNasi A standard +198μL di tampone di diluizione standard

    0,1 mg/ml

    2

    2μL di campione n. 1 + 198μL di tampone di diluizione standard

    1×10-3 mg/ml

    3

    2μL di campione n. 2 + 198μL di tampone di diluizione standard

    1×10-5 mg/ml

    4

    2μL di campione n. 3 + 198μL di tampone di diluizione standard

    1×10-7 mg/ml

    5

    100μL di campione n.4+100μL di tampone di diluizione standard

    5×10-8 mg/ml

    6

    100μL di campione n.5+100μL di tampone di diluizione standard

    2,5×10-8 mg/ml

    7

    100μL di campione n. 6+100μL di tampone di diluizione standard

    1,25×10-8 mg/ml

    8

    100μL di campione n. 7+100μL di tampone di diluizione standard

    6,25×10-9 mg/ml

    9

    100μL di campione n. 8+100μL di tampone di diluizione standard

    3. 125×10-9 mg/ml

    Quindi diluire i campioni n. 6 ~ n. 9 con acqua priva di DNasi e RNasi per 10 volte:

    10

    20μLNo.6 campioni+180μL di acqua priva di DNasi&RNasi

    2,5×10-9 mg/ml

    11

    20μL di campione n. 7+180μL di acqua priva di DNasi&RNasi

    1,25×10-9 mg/ml

    12

    20μL di campione n. 8+180μL di acqua priva di DNasi&RNasi

    6,25×10-10 mg/ml

    13

    20μL di campione n. 9+180μL di acqua priva di DNasi&RNasi

    3. 13×10-10 mg/ml

     

    I campioni n. 10 ~ n. 13 vengono utilizzati come standard;Acqua priva di DNasi e RNasi come campione a concentrazione 0.

    Testare insieme il campione a concentrazione 0, gli standard e il campione contaminato secondo le fasi di rilevamento per ottenere RFU0 e RFU30.

     

    Calcolare ∆RFU = RFU30-RFU0, prendere ∆RFU (concentrazione 0) e ∆RFU (standard) come ordinata e la concentrazione di RNasi dello standard come ascissa (la concentrazione 0 è 0), eseguire l'adattamento lineare e calcolare l'equazione di adattamento y = ax + B, e il coefficiente di correlazione r dovrebbe essere ≥ 0,99.Portare ∆RFU (campione contaminato) nell'equazione come y, calcolare x e moltiplicarlo per il multiplo di prediluizione del campione per ottenere il valore approssimativo della concentrazione del campione contaminato.

    Nota: a causa della fluttuazione del segnale dello strumento, è possibile che ∆RFU<0, in questo momento, venga calcolato come ∆RFU=0.

     

    Prestazioni di rilevamento

    1. Limite di rilevamento: RNasi A: 0,313 pg/mL, ~ 1,56×10-9U/μL

    2.Precisione: coefficiente di variazione intra lotto ≤ 10%, coefficiente di variazione inter lotto ≤ 15%

     

    Attenzione

    1. L'operazione di aggiunta del campione dovrebbe essere il più veloce possibile.Un tempo troppo lungo influenzerà l'accuratezza dell'esperimento.

    2. I parametri dei diversi strumenti di marcatura degli enzimi fluorescenti sono diversi.Impostare il guadagno appropriato prima del primo test.

    3. Tutti i reagenti devono essere completamente agitati prima dell'uso.Quando si aggiungono campioni, i campioni aggiunti devono essere aggiunti sul fondo del pozzetto della piastra dell'etichetta dell'enzima per evitare di aggiungerli alla parte superiore della parete del pozzetto.Quando si aggiungono i campioni, prestare attenzione a non schizzare o generare bolle.

    4. Lo standard nel kit è l'RNasi A e la sua unità attiva è definita come un'unità dell'enzima che provoca un aumento dell'assorbanza di 1,0 a 260 nm quando l'RNA del lievito viene idrolizzato a 37 °C e pH 5,0[1].Cinquanta unità equivalgono approssimativamente a 1 unità Kunitz[2].

    5.Per evitare la contaminazione esogena da RNasi, è possibile spruzzare DNase RNase away sulla superficie del tavolo sperimentale, sui guanti e su altre superfici.Dopo 5 minuti pulirli con carta assorbente pulita e quindi effettuare le successive operazioni sperimentali.

     

     

     

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