PNGase F
Il peptide-N-glicosidasi F (PNGase F) è il metodo enzimatico più efficace per rimuovere quasi tutti gli oligosaccaridi N-legati dalle glicoproteine.PNGase F è un'amidasi che si scinde tra i residui più interni di GlcNAc e asparagina di oligosaccaridi ad alto contenuto di mannosio, ibridi e complessi dalle glicoproteine N-linked.
Applicazione
Questo enzima è utile per la rimozione dei residui di carboidrati dalle proteine.
Preparazione e specificazione
| Aspetto | Liquido incolore |
| Purezza delle proteine | ≥95% (da SDS-PAGE) |
| Attività | ≥500.000 U/ml |
| Esoglicosidasi | Non è stata rilevata alcuna attività (ND) |
| Endoglicosidasi F1 | ND |
| Endoglicosidasi F2 | ND |
| Endoglicosidasi F3 | ND |
| Endoglicosidasi H | ND |
| Proteasi | ND |
Proprietà
| Numero CE | 3.5.1.52(Ricombinante da microrganismo) |
| Peso molecolare | 35 kDa (PAGINA SDS) |
| Punto isoelettrico | 8.14 |
| pH ottimale | 7.0-8.0 |
| Temperatura ottimale | 65 °C |
| Specificità del substrato | Scissione dei legami glicosidici tra GlcNAc e residui di asparagina Fig.1 |
| Siti di riconoscimento | Glicani N-legati a meno che non contengano α1-3 fucosio Fig. 2 |
| Attivatori | digitale terrestre |
| Inibitore | Scheda di sicurezza |
| Temperatura di conservazione | -25~-15℃ |
| Inattivazione del calore | Una miscela di reazione da 20 µl contenente 1 µl di PNGase F viene inattivata mediante incubazione a 75 °C per 10 minuti. |
Fig. 1 Specificità del substrato di PNGase F
Fig. 2 Sedi di riconoscimento di PNGase F.
Quando i residui GlcNAc interni sono collegati all'α1-3 fucosio, PNGase F non può scindere gli oligosaccaridi legati all'N dalle glicoproteine.Questa modifica è comune nelle piante e in alcune glicoproteine degli insetti.
Ccomponenti
|
| Componenti | Concentrazione |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×tampone denaturante della glicoproteina | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definizione di unità
Una unità (U) è definita come la quantità di enzima richiesta per rimuovere >95% dei carboidrati da 10 µg di RNasi B denaturata in 1 ora a 37°C in un volume di reazione totale di 10 µL.
Condizioni di reazione
1.Sciogliere 1-20 µg di glicoproteina con acqua deionizzata, aggiungere 1 µl di tampone denaturante per glicoproteine 10×e H2O (se necessario) per ottenere un volume di reazione totale di 10 µl.
2.Incubare a 100°C per 10 minuti, raffreddare in ghiaccio.
3.Aggiungere 2 µl di 10×GlycoBuffer 2, 2 µl di 10% NP-40 e mescolare.
4.Aggiungere 1-2 µl di PNGase F e H2O (se necessario) per ottenere un volume di reazione totale di 20 µl e mescolare.
5.Incubare la reazione a 37°C per 60 minuti.
6.Per analisi SDS-PAGE o analisi HPLC.
