Superstart qPCR Premix plus-UNG
N. cat.: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG è un reagente specializzato progettato per reazioni qualitative e quantitative Real Time PCR utilizzando il rilevamento basato su sonda, sviluppato specificamente per i processi di liofilizzazione.Contiene un nuovo enzima hot-start Hotstart Taq plus (DG), la cui attività enzimatica Taq è sigillata a temperatura ambiente, inibendo efficacemente l'amplificazione non specifica causata dalla ricottura non specifica del primer o dalla formazione di dimeri di primer in condizioni di bassa temperatura, migliorando così la specificità della reazione di amplificazione.Questo reagente utilizza un tampone specifico qPCR ottimizzato e un sistema anticontaminazione UNG/dUTP per ottenere un rapido avvio a caldo, migliorando notevolmente l'efficienza e la sensibilità delle reazioni qPCR.Può ottenere buone curve standard in un'ampia gamma di aree di quantificazione ed eseguire la quantificazione in modo accurato, prevenendo efficacemente l'amplificazione falsa positiva causata da prodotti PCR residui o contaminazione da aerosol.Questo reagente è compatibile con la maggior parte degli strumenti fluorescenti per PCR quantitativa di produttori quali Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad e Roche ecc. e presenta una buona stabilità in forma liofilizzata.
Composizione dei reagenti
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratuito) (DG)
2. MgCl 250 mM2
3. 4×lioprotettore (opzionale)
Condizioni di archiviazione
Conservazione a lungo termine a -20 ℃;può essere conservato a 4 ℃ per un massimo di 3 mesi.Mescolare bene prima dell'uso eevitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
Protocollo ciclistico
| Procedura | Temp. | Tempo | Ciclo |
| Digestione | 50℃ | 2 minuti | 1 |
| Attivazione della polimerasi | 95 ℃ | 1~5 minuti | 1 |
| Denaturare | 95 ℃ | 10~20 secondi | 40-50 |
| Ricottura ed estensione | 56~64℃ | 20~60 secondi | 40-50 |
qPCR reazione liquida SyPreparazione dello stelo
|
Composizione |
Volume 25 µl |
Volume 50 µl |
Concentrazione finale |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+gratuito) (DG) | 5 µl | 10 µl | 1× |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl | 0,9 µl | 4,5 mm |
| 4×lioprotettore1 | 6,25 µl | 12,5 µl | 1× |
| 25×Miscela primer-sonda2 | 1 µl | 2 µl | 1× |
| DNA modello3 | —— | —— | —— |
| DDH2O | A 25 µl | A 50 µl | —— |
1. Una concentrazione finale di 0,2μM per i primer solitamente produce buoni risultati;quando le prestazioni della reazione sono scarse, regolare la concentrazione del primer nell'intervallo 0,2-1μM secondo necessità.La concentrazione della sonda viene generalmente ottimizzata nell'intervallo 0,1-0,3μM attraverso esperimenti sul gradiente per trovare combinazioni ottimali.
2. Il numero di copie dei geni bersaglio contenuti in diversi tipi di modelli varia;se necessario, è possibile eseguire la diluizione in gradiente per determinare la quantità ottimale di aggiunta del modello.
3. Questo sistema può essere liofilizzato;quando i clienti utilizzano questo sistema senza requisiti di liofilizzazione, è possibile aggiungere selettivamente 4×lioprotettore; se sono richiesti prodotti liofilizzati, durante la convalida delle prestazioni del prodotto nella fase dei reagenti liquidi, è necessario aggiungere 4×lioprotettore per garantire la coerenza con i componenti del sistema liofilizzato ed effetti.
Quando il sistema è in usod per la liofilizzazione, preparare il sistema as seguente:
| Composizione | 25µl Sistema di reazione |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+gratuito) (DG) | 5 µl |
| 250 mM MgCl2 | 0,45 µl |
| 4×lioprotettore | 6,25 µl |
| 25×Miscela primer-sonda | 1 µl |
| DDH2O | A 18~20μL |
*Se sono necessari altri sistemi per la liofilizzazione, consultare separatamente.
Procedimento di liofilizzazioness
| Procedura | Temp. | Tempo | Condizione | Pressione |
| Precongelamento | 4℃ | 30 minuti | Presa |
1 atm |
| -50℃ | 60 minuti | Raffreddamento | ||
| -50℃ | 180 minuti | Presa | ||
| Essiccazione primaria | -30℃ | 60 minuti | Riscaldamento |
Vuoto definitivo |
| -30℃ | 70 minuti | Presa | ||
| Essiccazione secondaria | 25 ℃ | 60 minuti | Riscaldamento |
Vuoto definitivo |
| 25 ℃ | 300 minuti | Presa |
2. Il processo di liofilizzazione di cui sopra è solo di riferimento.Diversi tipi di prodotto e diversi liofilizzatori hanno parametri diversi, quindi è possibile apportare modifiche in base ai valori effettivicondizioni durante l'uso.
3. Diversi processi di liofilizzazione possono essere adatti a diverse dimensioni di lotti di liofilizzatoprodotti, quindi è necessario eseguire una validazione dei test sufficiente quando utilizzati per la produzione su larga scala.
Istruzioni per l'uso del liofilizzatopolvere d
1. Centrifugare brevemente la polvere liofilizzata;
2. Aggiungere il modello di acido nucleico alla polvere liofilizzata e aggiungere acqua fino a 25μL;
3. Mescolare bene mediante centrifugazione e far funzionare la macchina.
Controllo di qualità:
1. Test funzionali: sensibilità, specificità, riproducibilità della qPCR.
2. Nessuna attività nucleasica esogena, nessuna contaminazione endo/esonucleasica esogena.
Informazioni tecniche:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG utilizza un nuovo enzima hot-start che consente un rapido avvio a caldo entro 1~5 minuti;grazie alla speciale formulazione del tampone è adatto per reazioni PCR quantitative fluorescenti multiplex.
2. Ha una specificità più elevata che migliora significativamente la sensibilità del rilevamento del limite quantitativo della PCR a fluorescenza, consentendo la normalizzazione delle curve di amplificazione, il valore della fluorescenza ottiene un evidente miglioramento con modelli a bassa concentrazione, adatti come reagenti per il rilevamento quantitativo della PCR a fluorescenza ad alta sensibilità.
3. Per i primer con temperatura di ricottura inferiore o con frammenti più lunghi di 200 bp, si consiglia il metodo in 3 fasi.
4. L'efficienza di utilizzo del dUTP e la sensibilità all'enzima UNG differiscono per i diversi geni bersaglio, quindi se l'utilizzo del sistema UNG porta a una diminuzione della sensibilità di rilevamento, il sistema di reazione deve essere regolato e ottimizzato.Se è necessario supporto tecnico, contattare la nostra azienda.
5. Utilizzare aree e pipette dedicate prima e dopo l'amplificazione, indossare guanti durante il funzionamento e sostituirli frequentemente;non aprire la provetta di reazione dopo il completamento della PCR per ridurre al minimo la contaminazione dei campioni da parte dei prodotti della PCR.
