Kit Maxi Plasmide EndoFree
Questo kit è adatto per l'estrazione da 150 – 300 ml di soluzione batterica coltivata durante la notte, utilizzando un metodo di lisi alcalina SDS migliorato per lisare i batteri.L'estratto grezzo viene combinato selettivamente con un esclusivo Endotoxin Scavenger e separato mediante centrifugazione per rimuovere le endotossine.Quindi, la membrana di gel di silice si lega selettivamente al DNA plasmidico nella soluzione in condizioni di alto contenuto di sale e basso pH.Segue l'aggiunta del tampone di lavaggio per rimuovere le impurità e altri componenti batterici.Infine, viene utilizzato un tampone di eluizione a basso contenuto di sale e ad alto pH per eluire il DNA plasmidico puro dalla membrana della matrice di silicio.La membrana di gel di silice utilizza una speciale membrana di adsorbimento e la differenza nella quantità di adsorbimento tra la colonna e la colonna è molto piccola e la ripetibilità è buona.Non sono necessari fenolo, cloroformio e altri reagenti tossici, così come non lo sono le fasi di precipitazione dell'etanolo.Questo kit può essere utilizzato per estrarre rapidamente 0,2 -1,5 mg di DNA plasmidico puro ad alta copia, con una velocità di estrazione dell'80% -90%.Il kit utilizza una formula di processo unica che rimuove l'endotossina, il contenuto di endotossina è estremamente basso e l'effetto di trasfezione cellulare è eccellente.Il plasmide estratto potrebbe essere utilizzato direttamente nella digestione enzimatica, nella PCR, nella trascrizione in vitro, nella trasformazione, nel sequenziamento e in altri esperimenti di biologia molecolare.
Condizioni di archiviazione
L'RNasiA deve essere conservata a -30 ~ -15℃ e trasportata a ≤0℃.
Lo scavenger di endotossine può essere conservato a 2 ~ 8 ℃ per un mese, oppure a -30 ~ -15 ℃ per la conservazione a lungo terminee trasportato a ≤0℃.
Gli altri componenti devono essere conservati a temperatura ambiente (15 ~25 ℃) e trasportati a temperatura ambiente.
Componenti
| Componenti | 10RXNS |
| RNasi A | 750 µl |
| Tampone P1 | 75 ml |
| Tampone P2 | 75 ml |
| Tampone P4 | 75 ml |
| Scavenger di endotossine | 25 ml |
| PW buffer | 2×22ml |
| TBC tampone | 20 ml |
| Colonne FastPure DNA Maxi (ciascuna in una provetta di raccolta da 50 ml) | 10 |
| Provetta per prelievo priva di endotossine | 2×5 |
RNasiA:10 mg/ml, utilizzato per rimuovere l'RNA.
Buffer P1:tampone di sospensione batterica, aggiungere RNasiA al tampone P1 prima del primo utilizzo.
Buffer P2:tampone di lisi batterica (contenente SDS/NaOH).
Buffer P4:tampone neutralizzante.
Scavenger di endotossine:rimuovere efficacemente l'endotossina dall'estratto plasmidico grezzo.
Potenza buffer:tampone di lavaggio, aggiungere il volume previsto di etanolo prima del primo utilizzo.
TBC tampone:tampone di eluizione.
Colonne Maxi FastPure DNA:Colonne di adsorbimento del DNA plasmidico.
Provette per prelievo da 50 ml:tubi di raccolta del filtrato.
Provetta di raccolta priva di endotossine:Provette per la raccolta del DNA plasmidico.
Materiali preparati
Provette da centrifuga a fondo tondo da 50 ml per etanolo assoluto, isopropanolo e provette da 50 ml prive di endotossineprovette da centrifuga.
Applicazioni
Questo prodotto è adatto per l'estrazione su larga scala di plasmidi da 150 - 300 ml di soluzione battericacoltivato durante la notte.
Processo dell'esperimento
1. Prelevare 150 – 200 ml (non più di 300 ml) di soluzione batterica coltivata durante la notte e centrifugare acirca 11.000 giri/min (12.000 × g) per 1 – 2 min.Scartare il surnatante e raccogliere i batteri.
Δ Quando si raccolgono più di 50 ml di soluzione batterica, i batteri possono essere raccolti aggiungendo la soluzione batterica, centrifugando, scartando il surnatante e altri passaggi nella stessa provetta da 50 ml per
più volte.
2. Aggiungere 7,5 ml di tampone P1 (controllare se RNasiA è stata aggiunta al tampone P1) alla centrifugaprovetta contenente batteri e mescolare accuratamente mediante vortex o pipettando.
Δ La completa risospensione dei batteri in questa fase è fondamentale per la resa e non dovrebbero esserci grumi batterici dopo la risospensione.Se sono presenti grumi batterici non accuratamente miscelati, ciò influenzerà la lisi, con conseguente bassa resa e purezza.Se la OD600 della soluzione batterica è 0,65, si consiglia di utilizzare 7,5 ml di tampone P1 durante l'estrazione da 150 ml di soluzione batterica;quando OD600 è 0,75, devono essere utilizzati 8 ml di tampone P1 e i volumi dei tamponi P2 e P4 devono essere modificati di conseguenza.Se il volume della soluzione batterica viene aumentato a 200 ml, si consiglia diil volume dei tamponi P1, P2 e P4 deve essere aumentato proporzionalmente.
3. Aggiungere 7,5 ml di tampone P2 alla sospensione batterica del passaggio 2 e mescolare delicatamente su e giù per 6 – 8volte e incubare a temperatura ambiente per 4 – 5 min.
Δ Capovolgere delicatamente per mescolare accuratamente.L'utilizzo del vortex causerà la frammentazione del DNA genomico, con conseguente formazione di frammenti di DNA genomico nel plasmide estratto.A questo punto la soluzione diventa viscosa e traslucida, dimostrando che i batteri sono stati completamente lisati.La durata non deve superare i 5 minuti per evitare la distruzione dei plasmidi.Se la soluzione non è limpida, potrebbero essere presenti troppi batterilisi incompleta, quindi la quantità di batteri deve essere ridotta in modo appropriato.
4. Aggiungere 7,5 ml di Tampone P4 alla sospensione batterica del passaggio 3 e capovolgere immediatamente delicatamente 6 – 8 volte per consentire alla soluzione di neutralizzare completamente il Tampone P2.A questo punto dovrebbe apparire un precipitato flocculante bianco.Centrifugare a più di circa 11.000 giri/min (12.000 × g) per 10 – 15 minuti, pipettare con attenzione il surnatante in una nuova provetta da centrifuga a fondo tondo da 50 ml (autopreparata), ed evitareaspirare il precipitato bianco galleggiante.
Δ Aggiungere Buffer P4 e capovolgere immediatamente per mescolare bene.Lasciare riposare la provetta finché il precipitato bianco non si distribuisce uniformemente in tutta la soluzione per evitare la produzione di precipitazioni locali che potrebbero compromettere la neutralizzazione.Se non è presente un precipitato flocculante bianco uniforme prima della centrifugazione e il surnatante non è limpido dopo la centrifugazione, la provetta può esserecentrifugato per altri 5 min.
5. Aggiungere 0,1 volte il volume (10% del volume del surnatante, circa 2,2 ml) di Endotoxin Scavenger al surnatante del passaggio 4 e capovolgere per miscelare.Collocare la soluzione in un bagno di ghiaccio o inserirla nel ghiaccio tritato (o nel frigorifero/congelatore) per 5 minuti finché la soluzione non passa da torbida a limpida e trasparente (o ancoraleggermente torbido) e di tanto in tanto mescolare più volte.
Δ Dopo che l'Endotoxin Scavenger è stato aggiunto al supernatante, il supernatante diventerà torbido ma ilil surnatante dovrebbe diventare limpido (o leggermente torbido) dopo il raffreddamento nel bagno di ghiaccio.
6. Dopo che il surnatante è stato posto a temperatura ambiente (>25℃) per 10 – 15 minuti, diventerà torbido comela sua temperatura aumenta fino a raggiungere la temperatura ambiente.Quindi il surnatante dovrebbe essere invertito per miscelare.
Δ Se la temperatura ambiente è inferiore o si desidera ridurre il tempo di estrazione, il surnatante può essere incubato in un bagnomaria a 37 ~ 42 ℃ per 5 – 10 minuti e il passaggio successivo può essere eseguito dopo il surnatantediventa torbido.
7. Centrifugare il surnatante a circa 11.000 giri/min (12.000 × g) per 10 minuti a temperatura ambiente (la temperatura deve essere >25℃) per separare la fase.La fase acquosa superiore contiene il DNA mentre lo strato inferiore della fase oleosa blu contiene endotossina e altre impurità.Trasferisci ilFase acquosa contenente DNA in una nuova provetta eeliminare lo strato oleoso.
Δ La temperatura durante la centrifugazione deve essere superiore a 25 ℃ poiché una separazione di fase efficace non lo èverificarsi se la temperatura è troppo bassa.
Δ Se la separazione di fase non è efficace, la temperatura di centrifugazione può essere regolata a 30℃ eil tempo di centrifugazione può essere aumentato a 15 min.
Δ Non aspirare lo strato oleoso blu poiché contiene endotossine e altre impurità.
Meccanismo
Neutralizzazione della lisi con risospensione
◇ Aggiungere 7,5 ml di tampone P1
◇ Aggiungere 7,5 ml di tampone P2
◇ Aggiungere 7,5 ml di tampone P4
Rimozione delle endotossine
◇Aggiungere 0,1 volte il volume del surnatante di Endotoxin Scavenger
Rilegatura e lavaggio
◇ Aggiungere 0,5 volte il volume di isopropanolo
◇ Aggiungere 10 ml di tampone PW
◇ Aggiungere 10 ml di tampone PW
Eluizione
◇ Aggiungere 1 – 2 ml di tampone TB o ddH2O privo di endotossine
