Uracile DNA glicosilasi
L'uracile-DNA glicosilasi (UNG o UDG) è un clone ricombinante di E.coli con un peso molecolare di 25 kDa.Catalizza il rilascio di uracile libero dal DNA a filamento singolo e doppio contenente uracile, è inattivo contro l'RNA e può essere utilizzato per prevenire la contaminazione dei prodotti di amplificazione della PCR.Il principio di azione si basa sul fatto che se dUTP viene sostituito con dTTP nella reazione PCR e si forma un prodotto di amplificazione della PCR contenente basi dU, l'enzima può rompere selettivamente il legame glicosidico delle basi U in catene a filamento singolo e doppio. DNA e degradano il prodotto di amplificazione della PCR.
Applicazione consigliata
Amplificazione della prevenzione della contaminazione
Condizioni di conservazione
-20°C per la conservazione a lungo termine, deve essere miscelato bene prima dell'uso, evitare frequenti congelamenti e scongelamenti.
Buffer di archiviazione
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, stabilizzante, glicerolo al 50%.
Definizione di unità
La quantità di enzima necessaria per degradare 1μg di DNA a filamento singolo contenente basi dU in 1 ora a 37°C è 1 unità.
Controllo di qualità
1.Purezza elettroforetica SDS-PAGE superiore al 98%
2.Sensibilità di amplificazione, controllo batch-to-batch, stabilità
3.Dopo che 1U di UNG è stata trattata a 50℃ per 2 minuti, il modello contenente U inferiore a 103 copie dovrebbe essere completamente degradato e non è possibile produrre alcun prodotto di amplificazione
4.Nessuna attività nucleasica esogena
Istruzioni
| Componenti | Volume (μL) | Concentrazione finale |
| 10 × tampone PCR (senza dNTP, Mg²+gratuito) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200μM |
| dUTP (sostituisce dTTP) | - | 200-600μM |
| MgCl 25 mM2 | 2-8 µl | 1-4 mm |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × miscela di primerUN | 2 | 1× |
| Modello | - | <1μg/reazione |
| ddH₂O | A 50 | - |
Nota: a: Se utilizzata per qPCR/qRT-PCR, la sonda fluorescente deve essere aggiunta al sistema di reazione.Di solito, una concentrazione finale di primer di 0,2 μM può dare buoni risultati;quando le prestazioni della reazione sono scarse, la concentrazione del primer può essere regolata nell'intervallo 0,2-1 μM.Di solito, la concentrazione della sonda è ottimizzata nell'intervallo 0,1-0,3 μM.È possibile eseguire esperimenti sul gradiente di concentrazione per trovare la migliore combinazione di primer e sonda.
Appunti
1.L'enzima UNG può essere utilizzato per rimuovere i prodotti di amplificazione dUTP contaminati dal sistema di reazione prima della reazione di amplificazione PCR, quindi per evitare risultati falsi positivi dovuti alla contaminazione del prodotto.
2.La temperatura ottimale per l'utilizzo dell'enzima UNG nella reazione PCR anti-contaminazione è generalmente di 50 ℃ per 2 minuti;la condizione di inattivazione è di 95 ℃ per 5 minuti.
3.Evitare frequenti gelate e disgeli e non esporre a grandi sbalzi di temperatura.
4.Diversi geni da amplificare hanno diversa efficienza di utilizzo del dUTP e sensibilità all'enzima UNG, pertanto, se l'uso del sistema UNG porta ad una diminuzione della sensibilità di rilevamento, il sistema di reazione deve essere regolato e ottimizzato, se è necessario supporto tecnico, contattare la nostra azienda.
