Hotstart Taq DNA polimerasi
Hot Start Taq DNA Polymerase (modificazione dell'anticorpo) è una DNA polimerasi termostabile hot start del Thermus acquatico YT-1, che possiede un'attività polimerasica 5′→3′ e un'attività endonucleasica del lembo 5′.La Taq DNA polimerasi hot-start è una Taq DNA polimerasi modificata dagli anticorpi Taq termolabili.La modificazione dell'anticorpo ha aumentato la specificità, la sensibilità e la resa della PCR.
Componenti
| Componente | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×tampone HC Taq | 4×1ml | 4×10ml | 4×50 ml | 5×400ml |
| Hot Start Taq DNA polimerasi (anticorpo modificato) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5ml |
Applicazioni
Tris-HCl 10 mM (pH 7,4 a 25 ℃), KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, ditiotreitolo 1 mM, Tween20 0,5%, IGEPALCA-630 0,5% e glicerolo 50%.
Condizioni di conservazione
Trasporto a temperatura inferiore a 0°C e conservazione a -25°C~-15°C.
Definizione di unità
Una unità è definita come la quantità di enzima che incorpora 15 nmol di dNTP in materiale insolubile in acido in 30 minuti a 75°C.
Controllo di qualità
1.EndAttività onucleasica:L'incubazione di 20 U di enzima con 4 μg di DNA pUC19 per 4 ore a 37°C non ha prodotto alcuna degradazione rilevabile del DNA, come determinato mediante elettroforesi su gel.
2.PCR Lambda da 5 kb:25 cicli di amplificazione PCR di 5 ng di DNA Lambda con 1,25 unità di Taq DNA polimerasi in presenza di 200 µM dNTP e 0,2 µM di primer danno come risultato il prodotto previsto di 5 kb.
3.Attività di esonucleasi:L'incubazione di una reazione da 50 µl contenente un minimo di 12,5 U di Taq DNA polimerasi con 10 nmol di oligonucleotide 5'-FAM per 30 minuti a 37 ℃ non produce alcuna degradazione rilevabile.
4.Attività RNasi:L'incubazione di 10 µl di reazione contenente 20 U di enzima con 1 µg di trascritti di RNA per 2 ore a 37°C non ha prodotto alcuna degradazione rilevabile dell'RNA, come determinato mediante elettroforesi su gel.
5.Inattivazione del calore:NO.
Sistema di reazione
| Componenti | Volume |
| DNA modelloa | opzionale |
| Primer avanzato da 10 μM | 0,5 µl |
| Primer inverso da 10 μM | 0,5 µl |
| Miscela dNTP (10 mM ciascuno) | 0,5 µl |
| 5×tampone HC Taq | 5 µl |
| Taq DNA polimerasiB(5U/μL) | 0,125 µl |
| Acqua priva di nucleasi | Fino a 25 µl |
Appunti:
1) un.
| DNA | Quantità |
| Genomico | 1ng-1μg |
| Plasmide o virale | 1 pag-1 ng |
2) b.La concentrazione ottimale di Taq DNA polimerasi può variare da 5 a 50 unità/ml (reazione da 0,1 a 0,5 unità/25 µl) in applicazioni specializzate.
Protocollo di ciclismo termico
PCR
| Fare un passo | Temperatura(°C) | Tempo | Cicli |
| Denaturazione inizialea | 95 ℃ | 1-3 minuti | - |
| Denaturazione | 95 ℃ | 15-30 secondi | 30-35 cicli |
| RicotturaB | 45-68 ℃ | 15-60 secondi | |
| Estensione | 68 ℃ | 1kb/min | |
| Estensione finale | 68 ℃ | 5 minuti | - |
Appunti:
1) Una denaturazione iniziale di 1 minuto a 95°C è sufficiente per la maggior parte delle amplificazioni.Per modelli difficili, si consiglia una denaturazione più lunga di 2-3 minuti a 95°C.Con la PCR delle colonie, si consiglia una denaturazione iniziale di 5 minuti a 95°C.
2) La fase di ricottura dura tipicamente 15-60 s.La temperatura di ricottura si basa sulla Tm della coppia di primer ed è generalmente compresa tra 45 e 68 ℃.
