Proteinasi K mNGS (liquido)
La proteinasi K è una serina proteasi stabile con un'ampia specificità di substrato.Degrada molte proteine allo stato nativo anche in presenza di detergenti.Le prove provenienti da studi sulla struttura cristallina e molecolare indicano che l'enzima appartiene alla famiglia delle subtilisi con una triade catalitica del sito attivo (Asp39-Il suo69-Ser224).Il sito predominante di scissione è il legame peptidico adiacente al gruppo carbossilico degli amminoacidi alifatici e aromatici con gruppi alfa amminici bloccati.È comunemente usato per la sua ampia specificità.Questa proteinasi K è appositamente progettata per mNGS.Rispetto all'altra proteinasi K, contiene ancora meno contaminazione di acido nucleico con le stesse prestazioni enzimatiche, il che potrebbe garantire meglio l'applicazione mNGS a valle.
Condizioni di archiviazione
2-8℃ per 2 anni
Specifica
| Aspetto | Liquido da incolore a marrone chiaro |
| Attività | ≥800 U/ml |
| Concentrazione di proteine | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nessuno rilevato |
| DNasi | Nessuno rilevato |
| RNasi | Nessuno rilevato |
Proprietà
| Numero CE | 3.4.21.64(Ricombinante dall'album Tritirachium) |
| Punto isoelettrico | 7.81 |
| pH ottimale | 7.0-12.0 Fig. 1 |
| Temperatura ottimale | 65 ℃ Figura 2 |
| Stabilità del pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Stabilità termica | Sotto 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| Stabilità di stoccaggio | Oltre il 90% di attività per 12 mesi a 25 ℃ |
| Attivatori | Scheda di sicurezza, urea |
| Inibitori | Diisopropilfluorofosfato;fenilmetilsolfonilfluoruro |
Applicazioni
1. Kit diagnostico genetico
2. Kit per l'estrazione di RNA e DNA
3. Estrazione di componenti non proteici dai tessuti, degradazione delle impurità proteiche, come il DNAvaccini e preparazione di eparina
4. Preparazione del DNA cromosomico mediante elettroforesi pulsata
5. Western Blot
6. Diagnosi in vitro dei reagenti albumina glicosilata enzimatica
Precauzioni
Indossare guanti e occhiali protettivi durante l'utilizzo o la pesatura e mantenersi ben ventilati dopo l'uso.Questo prodotto può causare reazioni allergiche alla pelle e gravi irritazioni agli occhi.Se inalato può provocare sintomi allergici o asmatici o dispnea.Può causare irritazione respiratoria.
Definizione di unità
Una unità (U) è definita come la quantità di enzima necessaria per idrolizzare la caseina per produrre 1 μmoltirosina al minuto nelle seguenti condizioni.
Preparazione dei reagenti
Reagente I: 1 g di caseina del latte è stato sciolto in 50 ml di soluzione di fosfato di sodio 0,1 M (pH 8,0), incubato in acqua a 65-70 ℃ per 15 minuti, agitato e sciolto, raffreddato con acqua, regolato con idrossido di sodio a pH 8,0 e volume fisso 100 ml.
Reagente II: acido tricloroacetico 0,1 M, acetato di sodio 0,2 M, acido acetico 0,3 M.
Reagente III: Na 0,4M2CO3soluzione.
Reagente IV: Reattivo Fiorino diluito con acqua pura per 5 volte.
Reagente V: Diluente enzimatico: soluzione di fosfato di sodio 0,1 M (pH 8,0).
Reagente VI: soluzione di tirosina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml di tirosina disciolta con 0,2MHCl.
Procedura
1. 0,5 ml di reagente I vengono preriscaldati a 37 ℃, aggiungere 0,5 ml di soluzione enzimatica, mescolare bene e incubare a37℃ per 10 minuti.
2. Aggiungere 1 ml di reagente II per arrestare la reazione, mescolare bene e continuare l'incubazione per 30 minuti.
3. Centrifugare la soluzione di reazione.
4. Prendere 0,5 ml di supernatante, aggiungere 2,5 ml di reagente III, 0,5 ml di reagente IV, mescolare bene e incubare a 37 ℃per 30 minuti.
5. DE660è stato determinato come OD1;gruppo di controllo del bianco: 0,5 ml di reagente V vengono utilizzati per sostituire l'enzimasoluzione per determinare la OD660come OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Curva standard della L-tirosina: 0,5 ml di soluzione di L-tirosina a concentrazione diversa, 2,5 ml di reagente III, 0,5 ml di reagente IV in una provetta da centrifuga da 5 ml, incubare a 37 ℃ per 30 minuti, rilevare l'OD660per diverse concentrazioni di L-tirosina, si ottiene la curva standard Y=kX+b, dove Y è la concentrazione di L-tirosina, X è OD600.
Calcolo
2: volume totale della soluzione di reazione (mL)
0,5: volume della soluzione enzimatica (mL)
0,5: volume del liquido di reazione utilizzato nella determinazione cromogenica (mL)
10: Tempo di reazione (min)
Df: Diluizione multipla
C: Concentrazione degli enzimi (mg/mL)
Riferimenti
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U e Hilz H. Biochem.Biofisica.Ris.Comune.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Euro.J. Biochimica.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Clonazione molecolare: un manuale di laboratorio, 2a edizione, Cold Spring HarborLaboratorio Press, Cold Spring Harbor (1989).
Figure
Fico.1 Ottimale pH
Soluzione tampone 100 mM: pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glicina-NaOH. Concentrazione di enzimi: 1 mg/mL
Fig.2 Temperatura ottimale
Reazione in tampone K-fosfato 20 mM pH 8,0.Concentrazione dell'enzima: 1 mg/ml
Fig.3 pH Stabilità
25 ℃, trattamento di 16 ore con soluzione tampone 50 mM: pH 4,5-5,5, acetato;pH 6,0-8,0, Na-fosfato;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glicina-NaOH.Concentrazione dell'enzima: 1 mg/ml
Fig.4 Termico stabilità
Trattamento di 30 minuti con tampone Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentrazione dell'enzima: 1 mg/ml
Fig.5 Stoccaggio stability at 25 ℃
