Trascrittasi inversa RTL
La trascrittasi inversa RTL è una DNA polimerasi dipendente dal modello di RNA che manca dell'attività di esonucleasi 3'→5' e ha attività di RNasi H.Questo enzima può utilizzare l'RNA come modello per sintetizzare un filamento complementare di DNA, che può essere applicato alla sintesi del cDNA del primo filamento, in particolare per RT-LAMP (amplificazione isotermica mediata da loop).Rispetto alla trascrittasi inversa RTL 1.0, la sensibilità è significativamente migliorata, la stabilità termica è più forte e la reazione a 65°C è più stabile.La trascrittasi inversa RTL (priva di glicerolo) può essere utilizzata per preparare preparazioni liofilizzate, reagenti RT-LAMP liofilizzati, ecc.
Definizione di unità
Un'unità incorpora 1 nmol di dTTP nel materiale precipitabile con acido in 20 minuti a 50°C utilizzando poli(A)•oligo(dT)25 come primer modello.
Componenti
| Componente | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Trascrittasi inversa RTL (senza glicerolo) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| Buffer RTL 10×HC | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Condizioni di conservazione
Trasporto a temperatura inferiore a 0°C e conservazione a -25°C~-15°C.
Controllo di qualità
- Attività residua diEndonucleasi:Una reazione da 50 μL contenente 1 μg di λDNA e 15 unità di RTL2.0 incubata per 16 ore a 37 ℃ mostra lo stesso schema del controllo negativo mediante elettroforesi su gel.
- Attività residua diEsonucleasi:Una reazione da 50 μL contenente 1 μg di λDNA digerito Hind Ⅲ e 15 unità di RTL2.0 incubate per 16 ore a 37 ℃ mostra lo stesso schema del controllo negativo mediante elettroforesi su gel.
- Attività residua diNickase:Una reazione da 50 μL contenente 1 μg di pBR322 superavvolto e 15 unità di RTL2.0 incubate per 4 ore a 37°C mostra lo stesso schema del controllo negativo mediante elettroforesi su gel.
- Attività residua diRNasi:Una reazione da 10 μL contenente 0,48 μg di RNA MS2 e 15 unità di RTL2.0 incubata per 4 ore a 37°C mostra lo stesso schema del controllo negativo mediante elettroforesi su gel.
- Escherichia coli gDNA:Misurato conE.colikit specifici per il rilevamento dell'HCD, 15 unità di RTL2.0 ne contengono meno di 1Escherichia coligenoma.
Impostazione della reazione
Protocollo di sintesi del cDNA
| Componenti | Volume |
| RNA modello a | opzionale |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) o miscela di primer casuale (60uM) | 2μL |
| Miscela dNTP (10 mM ciascuno) | 1 ml |
| Inibitore della RNasi (40U/ul) | 0,5 µl |
| Trascrittasi inversa RTL 2.0 (15U/ul) | 0,5 µl |
| Buffer RTL 10×HC | 2μL |
| Acqua priva di nucleasi | Fino a 20 µl |
Appunti:
1) Il dosaggio raccomandato di RNA totale è 1ng~1μg
2) Il dosaggio raccomandato di mRNA era 50ng~100ng
Termo-ciclismo Condizioni per una routine reazione:
| Temperatura (°C) | Tempo |
| 25 °Ca | 5 minuti |
| 55 °C | 10 minutib |
| 80 °C | 10 minuti |
Appunti:
1) Se si utilizza Random Primer Mix, una fase di incubazione a 25°C.
2) Se viene utilizzata la miscela di primer target, una fase di incubazione a 55°C per 10~30 minuti.
Protocollo RT-LAMP
| Componenti | Volume | Concentrazione finale |
| Modello RNA | opzionale | ≥10 copie |
| Miscela dNTP (10 mM) | 3,5 µl | 1,4 mm |
| Primer FIP/BIP (25×) | 1 ml | 1,6μM |
| Primer F3/B3 (25×) | 1 ml | 0,2μM |
| Primer LoopF/LoopB (25×) | 1 ml | 0,4μM |
| Inibitore della RNasi (40U/μL) | 0,5 µl | 20 U/Reazione |
| Trascrittasi inversa RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 µl | 7,5 U/Reazione |
| Bst V2 DNA polimerasi (8U/μL) | 1 ml | 8 U/Reazione |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 µl | 6 mm (totale 8 mm) |
| Buffer 10×HC RTL (o 10×buffer HC Bst V2) | 2,5 µl | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Acqua priva di nucleasi | Fino a 25 µl | - |
Appunti:
1) Miscelare nel vortex e centrifugare brevemente per raccogliere.Incubazione a temperatura costante a 65°C per 1 ora.
2) I due buffer sono interoperabili e hanno la stessa composizione.
Appunti
1.Questo prodotto formerà un solido bianco se conservato a -20 °C.Toglierlo da -20°C e metterlo in ghiaccio per circa 10 minuti.Dopo lo scioglimento può essere utilizzato agitando e mescolando.
2.Il prodotto cDNA può essere conservato a -20°C o -80°C o utilizzato immediatamente per la reazione PCR.
3. Per prevenire la contaminazione da RNasi, mantenere pulita l'area sperimentale e indossare guanti e maschere puliti durante il funzionamento.
