DNA polimerasi Taq selvatica
La Taq DNA Polymerase è una DNA polimerasi termostabile del Thermus acquatico YT-1, che possiede un'attività polimerasica 5′→3′ e un'attività endonucleasica del lembo 5'.
Componenti
| Componente | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× Tampone Taq | 2×1 ml | 2×10 ml | 2×50ml | 5×200ml |
| Taq DNA polimerasi (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 5×10 ml |
Condizioni di conservazione
Trasporto a temperatura inferiore a 0°C e conservazione a -25°C~-15°C.
Definizione di unità
Una unità è definita come la quantità di enzima che incorpora 15 nmol di dNTP in materiale insolubile in acido in 30 minuti a 75°C.
Controllo di qualità
1.Saggio della purezza proteica (SDS-PAGE):La purezza della Taq DNA polimerasi è stata determinata ≥95% mediante analisi SDS-PAGE.
2.EndAttività onucleasica:Un minimo di 5 U di Taq DNA polimerasi con 1 μg di λDNA per 16 ore a 37 ℃ non determina alcuna degradazione rilevabile come determinato.
3.Attività di esonucleasi:Un minimo di 5 U di Taq DNA polimerasi con 1 μg di DNA digerito λ -Hind Ⅲ per 16 ore a 37 ℃ non determina alcuna degradazione rilevabile come determinato.
4.Attività del Nickase:Un minimo di 5 U di Taq DNA polimerasi con 1 μg di DNA pBR322 per 16 ore a 37°C non determina alcuna degradazione rilevabile come determinato.
5.Attività RNasi:Un minimo di 5 U di Taq DNA polimerasi con 1,6 μg di RNA MS2 per 16 ore a 37°C non determina alcuna degradazione rilevabile come determinato.
6.Escherichia coliDNA:5 U di Taq DNA polimerasi vengono sottoposte a screening per la presenza di DNA genomico di E. coli utilizzando TaqMan qPCR con primer specifici per il locus 16S rRNA di E. coli.La contaminazione del DNA genomico di E. coli è ≤1 copia.
7.Amplificazione PCR (DNA Lambda da 5,0 kb)- Una reazione da 50 µL contenente 5 ng di DNA Lambda con 5 unità di Taq DNA Polimerasi per 25 cicli di amplificazione PCR restituisce il prodotto previsto di 5,0 kb.
Impostazione della reazione
| Componenti | Volume |
| DNA modelloa | opzionale |
| Primer avanzato da 10 μM | 1 ml |
| Primer inverso da 10 μM | 1 ml |
| Miscela dNTP (10 mM ciascuno) | 1 ml |
| 10×taq tampone | 5 µl |
| Taq DNA polimerasiB | 0,25 µl |
| Acqua priva di nucleasi | Fino a 50 µl |
Appunti:
1) La concentrazione di reazione ottimale di diversi modelli è diversa.La tabella seguente mostra l'utilizzo consigliato del modello per il sistema di reazione da 50 µl.
| DNA | Quantità |
| Genomico | 1ng-1μg |
| Plasmide o virale | 1 pag-1 ng |
2) La concentrazione ottimale di Taq DNA Polimerasi può variare da 0,25 µL a 1 µL in applicazioni specializzate.
ReazioneProgramma
| Fare un passo | Temperatura(°C) | Tempo | Cicli |
| Denaturazione inizialea | 95 ℃ | 5 minuti | - |
| Denaturazione | 95 ℃ | 15-30 secondi | 30-35 cicli |
| RicotturaB | 60 ℃ | 15 secondi | |
| Estensione | 72 ℃ | 1kb/min | |
| Estensione finale | 72 ℃ | 5 minuti | - |
Appunti:
1) La condizione di denaturazione iniziale è adatta per la maggior parte delle reazioni di amplificazione e può essere modificata in base alla complessità della struttura del modello.Se la struttura del modello è complessa, il tempo di pre-denaturazione può essere esteso a 5 – 10 minuti per migliorare l'effetto di denaturazione iniziale.
2) La temperatura di ricottura deve essere regolata in base al valore Tm del primer, che generalmente è impostato su 3~5 ℃ inferiore al valore Tm del primer;Per modelli complessi, è necessario regolare la temperatura di ricottura ed estendere il tempo di estensione per ottenere un'amplificazione efficiente.
